沉默Smad4對豬卵巢顆粒細胞增殖及細胞周期的影響.pdf

1、顆粒細胞是卵巢中十分重要的細胞，在其發(fā)育的不同階段合成和分泌類固醇激素及多種生長因子，并通過自分泌/旁分泌途徑發(fā)揮作用。顆粒細胞的生長發(fā)育，增殖分化對卵泡發(fā)育有重要影響。TGF-β/Smad信號通路是影響顆粒細胞生長發(fā)育的重要信號通路，Smad4是該信號通路的核心下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，是TGF-β超家族信號由胞質(zhì)傳遞至胞核的必需因子。Smad4基因表達異常不但影響顆粒細胞自身生長發(fā)育，還會造成卵泡發(fā)育異常，甚至發(fā)生癌變，進而影響雌性動物的生

2、殖機能。
　　 本研究采用RNA干擾技術(shù)，設(shè)計并合成豬Smad4基因的靶向小分子干擾RNA，由LipofectamineTM RNAi Mix介導(dǎo)轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的豬卵巢顆粒細胞(Smad4-StealthTMRNA終濃度為13.3nM)，沉默顆粒細胞的Smad4基因。應(yīng)用熒光定量PCR法檢測RNAi對顆粒細胞Smad4表達的抑制率，應(yīng)用MTT法、流式細胞術(shù)檢測細胞增殖和細胞周期的變化，同時應(yīng)用熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)染前后Cyclin

3、 D1、CyclinB、Cyclin A2、Cdk1、Cdk2、Cdk4等周期相關(guān)基因的mRNA表達量的變化，以觀察Smad4對顆粒細胞增殖和細胞周期的影響。研究結(jié)果如下：
　　 (1)RNAi可以有效抑制顆粒細胞Smad4基因表達。干擾36h后，Smad4基因mRNA表達量的抑制率為79.85％(P＜0.01).
　　 (2)RNAi沉默顆粒細胞Smad4表達可以明顯抑制顆粒細胞增殖，干擾12h、24h、36h、48h

4、和72h后，顆粒細胞的增殖存活率分別為空白對照組的90.6％、87.2％、84.8％、82.7％、80.9％，差異均存在統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05).
　　 (3)RNAi沉默顆粒細胞Smad4基因表達可以阻滯細胞周期進程.流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染Smad4-StealthTM RNA36h后細胞周期變化，結(jié)果顯示，G0/G1期細胞比例由平均86.84％（空白對照組）升高到92.82％（Smad4干擾組）(P＜0.05), S期細胞比例

5、由平均6.13％（空白對照組）降低到1.64％（Smad4干擾組）(P＜0.05), G2/M期細胞比例變化不明顯。用熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)染Smad4-StealthrM RNA對顆粒細胞Cyclin D1、Cyclin B、Cyclin A2、Cdk1、Cdk2、Cdk4等周期相關(guān)基因mRNA表達量的影響，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染36h后，以上幾種基因的mRNA表達量分別降低到對照組的41.9％、77.3％、22.3％、64.3％、48.0％和61.