兩個(gè)ABCG轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白OsABCG26和OsABCG15協(xié)同調(diào)控水稻花藥及花粉發(fā)育.pdf

1、水稻是重要的單子葉模式研究植物，也是最重要的糧食作物之一，作為水稻雄性生殖細(xì)胞的花粉的發(fā)育與水稻的產(chǎn)量緊密相關(guān)，同時(shí)水稻雜交育種也離不開對(duì)雄性不育系的利用。因而深入了解雄性生殖細(xì)胞花粉的發(fā)育機(jī)理，對(duì)提高水稻產(chǎn)量極為重要。我們通過(guò)60Coγ射線對(duì)粳稻品種9522進(jìn)行輻射誘變獲得突變體庫(kù)，并通過(guò)遺傳篩選得到一個(gè)單基因控制的雄性不育突變體，通過(guò)圖位克隆分離到控制該雄性不育表型的基因 OsABCG26，同時(shí)，我們對(duì) OsABCG26功能缺失突變

2、體 osabcg26進(jìn)行了詳細(xì)的表型分析并深入研究了其生物學(xué)功能。主要研究結(jié)果如下：
　　植物表皮角質(zhì)層對(duì)植物抵御環(huán)境壓力起到關(guān)鍵作用，植物營(yíng)養(yǎng)器官角質(zhì)層的發(fā)育機(jī)制已經(jīng)被深入的研究，然而雄性生殖器官花藥角質(zhì)層的發(fā)育機(jī)制仍不清楚。為研究水稻花藥角質(zhì)層發(fā)育機(jī)制,我們分離到一個(gè)花藥角質(zhì)層缺陷的雄性不育突變體osabcg26。成熟期的osabcg26突變體花藥呈白色，并且小于野生型花藥。半薄切片分析發(fā)現(xiàn)，由于osabcg26突變體絨氈層不

3、正常降解和花粉粒沒(méi)有內(nèi)含物的形成導(dǎo)致花藥腔最終塌陷，甲苯胺藍(lán)染色很深的物質(zhì)充滿花藥腔。SEM和TEM電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，osabcg26突變體花藥表面光滑，角質(zhì)層不能正常形成，花粉外壁外層和外壁內(nèi)層之間部分在發(fā)育后期消失。生化測(cè)定發(fā)現(xiàn)，osabcg26突變體花藥表面角質(zhì)層角質(zhì)和蠟質(zhì)的沉積量都低于野生型，特別是角質(zhì)沉積量發(fā)生劇烈的下降。利用圖位克隆和互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)分析，我們發(fā)現(xiàn)10號(hào)染色體短壁上OsABCG26基因在655th位置處發(fā)生一個(gè)堿基的置換

4、導(dǎo)致osabcg26突變體雄性不育，OsABCG26編碼一個(gè)ABCG亞家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。
　　為了確定 OsABCG26的具體功能，我們對(duì) OsABCG26基因的表達(dá)模式和OsABCG26蛋白定位進(jìn)行了詳細(xì)分析。利用定量RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，該基因在花藥中高度表達(dá)，且在花藥發(fā)育的第十期，表達(dá)量最高，在根、莖、葉和其他非生殖花器官有低量的表達(dá)，然而在雌蕊中也有高度表達(dá)。啟動(dòng)子活性分析顯示OsABCG26在花藥表皮層、內(nèi)層和絨氈層都高度表

5、達(dá)。為了確定OsABCG26蛋白亞細(xì)胞定位，我們構(gòu)建了PSAT6-eYFP-OsABCG26表達(dá)載體，并瞬時(shí)轉(zhuǎn)化到洋蔥表皮細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn) OsABCG26蛋白定位在細(xì)胞質(zhì)膜上。同時(shí)，我們把雙元載體pCAMBIA1301-pOsABCG26-eYFP-OsABCG26導(dǎo)入到突變體osabcg26中，結(jié)果顯示eYFP-OsABCG26融合蛋白能夠互補(bǔ)osabcg26突變體的不育表型，表明eYFP-OsABCG26是有功能的融合蛋白。利用激光共

6、聚焦熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，在花藥發(fā)育的第九期，eYFP-OsABCG26定位在花藥壁表皮層、內(nèi)層和絨氈層的質(zhì)膜上，此時(shí)，中層降解的幾乎不可見。同時(shí)，定量分析發(fā)現(xiàn)絨氈層表達(dá)的涉及花藥角質(zhì)層脂類代謝的基因CYP704B2、CYP703A3和DPW在osabcg26突變體中表達(dá)量都發(fā)生顯著性下降。以上結(jié)果表明，OsABCG26主要涉及花藥角質(zhì)層前體從絨氈層到花藥表面的轉(zhuǎn)運(yùn)。
　　我們以前鑒定到另一個(gè)ABCG轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因OsABCG15，o

7、sabcg15突變體花藥角質(zhì)層和花粉外壁都不能正常形成，并發(fā)現(xiàn) OsABCG15在花藥絨氈層高度表達(dá)。然而 OsABCG15蛋白定位一直不清楚。本研究中，我們通過(guò)eYFP-OsABCG15融合蛋白瞬轉(zhuǎn)煙草發(fā)現(xiàn)ABCG15定位在細(xì)胞質(zhì)膜上，同時(shí)將雙元載體pCAMBIA1301-pOsABCG15-eYFP-OsABCG15導(dǎo)入到突變體osabcg15中，結(jié)果能互補(bǔ)osabcg15的不育表型，說(shuō)明eYFP-OsABCG15等同于OsABCG

8、15的功能。熒光觀察發(fā)現(xiàn) OsABCG15特異性定位在絨氈層細(xì)胞膜上，并呈現(xiàn)面向花藥腔一側(cè)的極性定位。并且 osabcg15突變體沒(méi)有花粉壁的形成，以上結(jié)果表明OsABCG15主要涉及孢粉素前體的轉(zhuǎn)運(yùn)。
　　以前我們報(bào)道，OsABCG15功能突變導(dǎo)致花藥在減分后呈現(xiàn)發(fā)育缺陷，包括絨氈層不正常降解、花粉外壁和花藥角質(zhì)層結(jié)構(gòu)缺陷等。為了解 OsABCG15和OsABCG26的功能關(guān)系，我們構(gòu)建了osabcg26 osabcg15雙突變

9、體。組織切片發(fā)現(xiàn)osabcg26 osabcg15雙突變體花藥外壁光滑、花粉外壁不能正常形成并且最后降解。生化分析也發(fā)現(xiàn) osabcg26 osabcg15雙突變體蠟質(zhì)含量比 osabcg26或osabcg15單突變體更低。osabcg26 osabcg15雙突變體角質(zhì)含量與 osabcg26或osabcg15單突變體相比沒(méi)有明顯的變化。總體上，osabcg26 osabcg15雙突變體表型類似于osabcg15單突變體表型。