麻瘋樹（Jatropha curcas）花藥培養(yǎng)及兩個核糖體失活蛋白基因的表達研究.pdf

1、pU川人學博lj學位論文暗培養(yǎng)條件下，1／2MSIAA01mg／L的培養(yǎng)基能誘導愈傷組織生根，但分化率很低，僅667％。2研究了不同激素組合和培養(yǎng)方式對花藥愈傷組織中PPO和POD活性的影響。結果表明，固體培養(yǎng)過程中，PPO和POD活性都出現(xiàn)2次活性高峰，一次在3d，一次在21d(添加N從的出現(xiàn)在24d)，分別與逆境和生長旺盛期相關，懸浮培養(yǎng)出現(xiàn)1次，在12d，出現(xiàn)在生長旺盛期；添加24D和NAA的培養(yǎng)基培養(yǎng)的愈傷組織中，PPO和POD

2、的活性要高于添加IBA和IAA的，添加KT的，活性要高于添加6BA的；光照造成培養(yǎng)方式對PPO活性的影響要大于對POD的影響；在早期PPO和POD的活性都出現(xiàn)高峰，隨時『日J的推移，活性都會下降，PPO的下降趨勢遠高于POD。3兩個原核表=i厶拽體的構建：『1J根捌curcin2基因序列(GenBank奇錄號：AY435214)設計的擴增成熟肽編碼區(qū)的特異性引物：P1：5’一GGATCC(BamHI)ATGGCTGGTTCCACTT7f

3、3’；P2：5GAGCTC(SacI)ATAcArTGGAAAGATGAGGA3’，以提取的麻瘋樹基因組D1qA為模板進行PCR擴增，回收PCR產(chǎn)物并連接到pMDl8T載體，獲重組子pMD18T／curein2，轉化EcoliJMl09。經(jīng)測序以驗證目的片段序列的正確性。用BamHI和SacI對重組質粒pMD—18T／curcin和表達載體pET32(c)=pQE一30進行雙酶切，回收目的片段，得到帶互補粘性術端的curcin2基因片段

4、(約930bp)和pET32(c)、pQE30的線性表達載體。用T4DNA連接酶將所得的目的片斷分別與線形表達質粒pET32(c)、pQE一30在1(℃下連接，以構建重組表達載體pETC和pQEC。并將連接產(chǎn)物轉入感受態(tài)的EcoliJMl09，經(jīng)菌落PCR、雙酶切及測序鑒定，證明目的片段curcin2正確插入表達載體，成功構建原核表達載體pETC和pQEC。。4兩種重組菌的誘導表達：將含有重組子pETC、pQEC的EcoliJMl09轉

5、化菌于37℃下擴大培養(yǎng)，并提耿質粒。把重組質粒pETC轉入感受態(tài)的EcoliBL21，重組質粒pQE—C轉入感受態(tài)的EcoliM15。經(jīng)菌落PCR、雙酶切及測序鑒定，證明成功獲得轉化子PCB和PCM。用不同的誘導溫度，不同的誘導時間及不同的IPTG誘導濃度同時作用兩種重組菌PCB和PCM。經(jīng)SDSPAGE和Westernblotting檢測，結果表明，在任何誘導條件下，重組子PCB都沒有curcin2重組蛋白產(chǎn)生，而PCM都能表達出cu