重組牛凝血酶原-2包涵體的體外重折疊復(fù)性研究.pdf

1、凝血酶是目前應(yīng)用最為廣泛的一種止血劑,在臨床上有非常重要的用途。凝血酶原-2(pThr-2)是α-凝血酶生成過程中的分子量最小的單鏈中間前體,經(jīng)激活后可轉(zhuǎn)化為有活性的α-凝血酶。本論文通過將含凝血酶原-2基因的質(zhì)?？寺≈链竽c桿菌中并得到大量表達(dá),但這樣獲得的凝血酶原為包涵體形式,必須經(jīng)過體外復(fù)性后,再激活為凝血酶。本文在優(yōu)化發(fā)酵條件獲得高產(chǎn)量的重組牛凝血酶原-2包涵體的基礎(chǔ)上,對牛凝血酶原-2的體外重折疊復(fù)性如稀釋復(fù)性以及溫敏型聚N-異

2、丙基丙烯酰胺(PNIPA)凝膠和二硫鍵異構(gòu)酶(DsbA)介導(dǎo)的復(fù)性進(jìn)行了詳細(xì)的研究。將攜帶已克隆pThr-2基因的質(zhì)粒成功地轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后繼續(xù)培養(yǎng),獲得凝血酶原-2包涵體。對培養(yǎng)基組成及操作條件進(jìn)行了優(yōu)化,詳細(xì)考察了碳源、氮源、無機(jī)鹽、誘導(dǎo)起始時間、誘導(dǎo)劑添加量、接種量、發(fā)酵溫度和轉(zhuǎn)速等因素對目標(biāo)蛋白表達(dá)量的影響。最終在優(yōu)化的培養(yǎng)條件下,重組凝血酶原-2包涵體的產(chǎn)量為110 mg/L發(fā)酵液,占菌體總

3、蛋白的21.7％。將收集的菌體用超聲波破碎后,離心得到pThr-2包涵體,然后Tris-HCl緩沖液洗滌包涵體,并優(yōu)化了洗滌液組成。包涵體用8 M尿素(含0.3 MDTT)溶解后,在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用一次回歸正交試驗(yàn)及快速登高試驗(yàn),綜合考察了pThr-2包涵體稀釋復(fù)性過程的關(guān)鍵參數(shù),包括GSSG濃度、GSSG/GSH比例、尿素濃度、PEG6000濃度、L-Arg添加量以及復(fù)性溫度等。凝血酶活力用生色底物法測定,結(jié)果在優(yōu)化條件下凝血

4、酶活力可達(dá)2948U/mL。在稀釋復(fù)性的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步考察了添加溫敏型PNIPA凝膠和DsbA協(xié)助凝血酶原-2體外復(fù)性的效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,加入凝膠協(xié)助復(fù)性后凝血酶活力可達(dá)6222 U/mL,凝膠的最佳添加量為105 mg/mL,且復(fù)性初始蛋白濃度越高,凝膠協(xié)助復(fù)性的效果就越明顯;但PNIPA凝膠的加入在協(xié)助復(fù)性的同時,也在一定程度上延長了復(fù)性達(dá)到平衡所需的時間。我們將含有DsbA基因的pAVD63質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中,并在優(yōu)化的培養(yǎng)條