重組尿激酶原突變體的構(gòu)建與表達(dá).pdf

1、為了獲得高特異性的溶栓藥物,將RGDS和GPRP作為雙專(zhuān)一性的導(dǎo)向小肽分子插入到低分子量尿激酶原(scu-PA-32K,Leu144~Leu411)N端,同時(shí)為了提高低分子量尿激酶原的半衰期和增加對(duì)PAI-1抑制及凝血酶滅活的抗性,刪除了編碼尿激酶原151~157位(Lys-Thr-Leu-Arg-Pro-Arg-Phe)和179~184位(Arg-His-Arg-Gly-Gly-Ser)氨基酸的核苷酸,從而構(gòu)建了一種新型的溶栓分子--

2、尿激酶原突變體GZ1-sPA.為了獲得有活性的重組表達(dá)產(chǎn)物,嘗試了大腸桿菌E. coli和畢赤巴斯德酵母表達(dá)系統(tǒng)來(lái)對(duì)尿激酶原突變體GZ1-sPA進(jìn)行重組表達(dá),并在大腸桿菌中獲得成功表達(dá).在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中,構(gòu)建了GZ1-sPA基因的C端融合6×His親和標(biāo)簽的原核表達(dá)載體pET21b-GZ1-sPA,篩選出穩(wěn)定表達(dá)的菌株BL21(DE3)pLysS.與此同時(shí),還構(gòu)建了GZ1-sPA基因的融合表達(dá)質(zhì)粒pTRX-GZ1-sPA,融合蛋白的

3、表達(dá)量高,達(dá)到40％以上,融合蛋白切割后在纖維平板上顯示出纖溶活性.pET21b-GZ1-sPA表達(dá)體系的重組蛋白以包涵體形式存在,SDS-PAGE上顯示分子量約為31KD,Western blot檢測(cè)證明重組蛋白可與抗尿激酶的單克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合.表達(dá)產(chǎn)物用鹽酸胍溶解后,在Ni<'2+>親合層析柱上復(fù)性,經(jīng)一步分離純化后,純化產(chǎn)物在纖維蛋白板上表現(xiàn)出較好的纖溶活性.抗血小板聚集實(shí)驗(yàn)證明它可以起到顯著的抗活化血小板聚集的作用.實(shí)驗(yàn)結(jié)