小鼠重組sTNF-a的構(gòu)建、表達(dá)及其蛋白純化.pdf

1、腫瘤壞死因子（TNF-a）是一種主要由活化的單核/巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的多效性細(xì)胞因子，可介導(dǎo)不同靶細(xì)胞增殖、分化、壞死及凋亡，具有廣泛的免疫調(diào)節(jié)作用和病理生理作用，它在體內(nèi)以跨膜型（Transmembrane TNF-a，mTNF-a）和分泌型（secreted TNF-a，sTNF-a）兩種形式發(fā)揮作用。近來研究報(bào)道，在慢性炎癥的局部和腫瘤組織中聚集有大量的未成熟髓樣抑制細(xì)胞（myeloid derived suppressor cell，

2、MDSC），包括未成熟的巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和粒細(xì)胞等，具有很強(qiáng)的免疫抑制作用，是引起腫瘤免疫逃逸的重要細(xì)胞群體[5-8]。有研究發(fā)現(xiàn)：MDSC浸潤(rùn)腫瘤組織后可分化為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）和血管內(nèi)皮細(xì)胞[9]，這兩類細(xì)胞又是腫瘤組織中主要的基質(zhì)細(xì)胞，能分泌大量TNF-a，TAM表達(dá)的跨膜型TNF-a能通過細(xì)胞間直接接觸而介導(dǎo)活化的CD8+T細(xì)胞凋亡，這些數(shù)據(jù)提示MDSC的聚集及其免疫抑制功能很與TNF-a有關(guān)。為研究跨膜型和分泌型T

3、NF-a對(duì)髓樣抑制細(xì)胞功能的影響及其機(jī)制，本課題構(gòu)建了鼠sTNF-pTriex4hisC重組質(zhì)粒并高效表達(dá)了鼠sTNF-a重組蛋白，為后續(xù)的科研工作創(chuàng)造了條件。本研究主要內(nèi)容如下：
　　 ㈠WT-TNF-pcDNA3.1C重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定。
　　 ⑴提取小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的總RNA，采用RT-PCR擴(kuò)增出野生型TNF-a （WT-TNF）的cDNA片斷；同時(shí)，抽提質(zhì)粒pcDNA3.1C，將二者分別用BamHI和EcoR

4、 I雙酶切后，經(jīng)回收、連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，挑選陽(yáng)性克隆。
　　 ⑵陽(yáng)性克隆的鑒定：以菌落PCR初步篩選陽(yáng)性克隆，再用上述限制性內(nèi)切酶雙酶切鑒定，結(jié)果顯示重組體經(jīng)酶切后，得到約708bp左右的目的片斷，與連接的目的基因大小一致。進(jìn)一步經(jīng)DNA測(cè)序分析鑒定，證明成功構(gòu)建了插入有WT-TNF全長(zhǎng)序列的重組質(zhì)粒鼠WT-TNF-pcDNA3.1C。
　　 ㈡sTNF-pTriex4hisC重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定。
　　

5、 ⑴重組體的構(gòu)建和克?。阂訵T-TNF-pcDNA3.1C質(zhì)粒為模板，采用重疊PCR方法刪除WT-TNF中的信號(hào)肽序列，從而得到僅僅只含有分泌型TNF-a的DNA序列片段，再用BamHI和EcoR I將該目的基因和 pTriex4hisC載體（此載體中含組氨酸his標(biāo)簽，有利于后續(xù)的蛋白純化）進(jìn)行雙酶切，然后，經(jīng)回收、連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，挑選陽(yáng)性克隆。
　　 ⑵陽(yáng)性克隆的鑒定：以菌落PCR初步篩選陽(yáng)性克隆，再用上述限制

6、性內(nèi)切酶雙酶切進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示重組體經(jīng)酶切后，得到約471bp左右的目的片斷，與連接的目的基因大小一致。進(jìn)一步經(jīng)DNA測(cè)序分析鑒定，證明成功構(gòu)建鼠sTNF-pTriex4hisC重組質(zhì)粒。
　　 ㈢鼠sTNF-a融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定。
　　 將sTNF-a-pTriex4hisC重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大腸桿菌BL-21，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，獲得鼠融合蛋白sTNF-a；用Ni2+－NTA介質(zhì)分離純化sTNF-a蛋白后，經(jīng)SDS－P