納米液態(tài)氟碳球囊的制備及其體內外靶向超聲顯影增強的研究.pdf

1、1.研究背景及目的
　　靶向超聲分子成像技術是指將特異性配體如抗體偶聯(lián)至超聲造影劑表面，經(jīng)血液循環(huán)特異性地積聚于靶組織，達到靶向超聲分子成像目的。具有價廉、無毒、無創(chuàng)、無放射污染、敏感度高、易探測、實時、可重復等優(yōu)點。良好的靶向造影劑應具備:能特異性與靶位緊密結合;有足夠穩(wěn)定時間在靶位循環(huán)、積聚;較低劑量即可快速實現(xiàn)靶位與背景的高對比率;好的生物相容性等特質。目前臨床采用的超聲造影劑多為氣態(tài)核心如SonoVueTM為微米級，平均直

2、徑在2μm-4μm，但無靶向功能，且不能透過血管壁，無法直接實現(xiàn)血管外病變靶向顯影，因此限制了其在臨床上的應用。液態(tài)PFCs核心高分子球囊（Liquid perfluorocarbons-filled nanocapsules，LNCs）具有更好的穩(wěn)定性、穿透性和超聲反射等特質，能更好地抵抗超聲波聲壓和機械力作用而成為國內外研究的熱點，是目前一種具有較好應用前景的超聲造影劑。但目前的研究主要集中在不同材質殼膜的球囊的制備和顯影特性等方面

3、，球囊靶向修飾、影響粒徑大小的因素、不同粒徑納米顆粒的理化性質、粒徑大小和濃度與超聲散射的關系、體內超聲造影增強效果、生物分布和生物安全性等研究尚不明確。因此，本研究旨在靶向修飾并篩選出最佳粒徑和濃度的LNCs特異性靶向靶標VEGFR2受體，探討用于裸鼠HepG2種植瘤模型靶向超聲顯影增強的研究。
　　2.實驗方法
　　2.1乳化-蒸發(fā)法制備DSPE-PEG修飾的LNCs，單因素實驗研究均質分散速度、超聲粉碎時間和功率對球囊

4、粒徑大小的影響。
　　2.2用聚碳酸酯過濾器及梯度離心法分離純化LNCs，將其依粒徑大小分為四組，光鏡、熒光顯微鏡及投射電鏡和掃描電鏡下觀察球囊形態(tài)、結構; DLS法測球囊粒徑和表面電位;疏水層析實驗驗證球囊的親水特性; MTT法測各粒徑球囊對人HUEVC細胞增值的影響。
　　2.3體外實驗觀測球囊粒徑大小與球囊濃度高低同超聲造影增強效應的關系，并體外實驗行LNCs結構和超聲反射強度穩(wěn)定性評估。
　　2.4選擇合適粒徑

5、和濃度的LNCs耳緣靜脈注射入新西蘭兔，觀察球囊體內造影增強效應。
　　2.5制備合適粒徑的biotin-LNCs，通過biotin-avidin system制VEGFR2受體靶向的納米球囊(V2-LNCs)。熒光免疫試驗驗證biotin-LNCs與配體biotin-labeled anti-VEGFR2抗體的結合。
　　2.6光鏡、熒光顯微鏡及投射電鏡和掃描電鏡下觀察靶向修飾對球囊形態(tài)、結構的影響; DLS法測V2-LN

6、Cs粒徑和表面電位;疏水層析實驗驗證V2-LNCs的親水特性; MTT法測V2-LNCs對人HUEVC細胞增值的影響;體外超聲顯影實驗觀察靶向修飾對球囊超聲造影增強特性的影響。
　　2.7體外細胞結合試驗:設PBS、 V2-LNCs、 LNCs、IgG-LNCs四組分別與人HUEVC細胞和人HepG2細胞孵育2h;用anti-VEGFR2抗體預處理細胞后再與V2-LNCs孵育做阻斷試驗;將V2-LNCs分別與細胞孵育0.5h和1.

7、5h的時間，觀察V2-LNCs結合效率與孵育時間的關系。
　　2.8體內實驗觀察V2-LNCs與LNCs對裸鼠人HepG2細胞種植瘤模型的超聲顯影增強效應（分別經(jīng)尾經(jīng)脈和瘤內注射）。免疫熒光觀察其在尾經(jīng)脈注射組瘤內的分布差異。
　　2.9 V2-LNCs與LNCs分別經(jīng)尾經(jīng)脈注射ICR小鼠，免疫熒光分析分別觀察V2-LNCs與LNCs在小鼠主要臟器的分布，并收集小鼠全血，測其血清中ALT/AST等指標評估其生物安全性。

8、>　　3.實驗結果
　　3.1制備了不同粒徑的DSPE-PEG修飾的LNCs，其平均粒徑隨均值速度、超聲粉碎時間和功率的增加而降低。
　　3.2不同粒徑下LNCs大小均勻、呈球形、具有殼核結構;有較好的親水特性;各粒徑球囊對人HUEVC細胞增值無太大影響。
　　3.3體外超聲顯影增強實驗:粒徑為220nm-450nm的LNCs球囊在0.05 mg/mL、0.5 mg/mL、5 mg/mL、50 mg/mL時都具有較好的

9、超聲反射特性，適宜用于體內顯影增強。在低濃度(0.005 mg/mL)時LNCs粒徑大小與超聲造影增強效應呈正相關。高濃度(50 mg/mL)時出現(xiàn)聲衰減，且衰減程度隨粒徑增加而增加。濃度為0.05 mg/mL、0.5 mg/mL、5 mg/mL時，粒度≤100 nm的LNCs超聲反射強度較弱。穩(wěn)定性觀察示LNCs大小和超聲反射具有良好的穩(wěn)定性。
　　3.4粒徑為220nm-450 nm的LNCs以濃度5 mg/mL，100μL/

10、Kg耳緣靜脈注射入新西蘭兔體內后，可明顯增強其血管和肝腎超聲反射效果。
　　3.5制備了粒徑為220nm-450 nm的biotin-LNCs，并通過biotin-avidin system制備了V2-LNCs。熒光免疫試驗陽性，證明配體biotin-labeled anti-VEGFR2antibody與biotin-LNCs結合。
　　3.6靶向修飾后球囊形態(tài)、結構無改變;粒徑和表面電位無明顯變化;仍具親水特性;對人HU

11、EVC細胞的增值無影響;對體外超聲顯影增強特性無影響。
　　3.7體外細胞結合試驗:V2-LNCs能較好的黏附在人HUEVC細胞和人HepG2細胞上，反復洗滌不掉，用anti-VEGFR2抗體預封閉細胞可成功阻斷其與細胞的靶向結合，而作為對照的LNCs、 IgG-LNCs經(jīng)反復洗滌后納米球囊與細胞完全分離，無結合，空白PBS組細胞無紅色熒光。 V2-LNCs與人HUEVC細胞和人HepG2細胞具有較強的靶向結合能力，且結合效率與孵

12、育時間相關。
　　3.8體內超聲顯影實驗:V2-LNCs和LNCs瘤內注射組腫瘤超聲顯影效果均增強;而尾經(jīng)脈注射組在注射當時和0.5h，1h，2h，4h，12h，24h二者均未見明顯的超聲散射效果增強。熒光免疫實驗顯示V2-LNCs在瘤內血管內皮和腫瘤實質蓄積較LNCs組明顯增多。證明V2-LNCs能粘附并透過腫瘤血管壁，通過靶向結合作用積聚于腫瘤實質和血管內皮。顯示LNCs積聚并不是超聲顯影增強的唯一決定因素。
　　3.9

13、生物分布和生物安全性:球囊在ICR小鼠主要臟器均有分布，其ALT，AST，TBA，LDH等指標無異常，主要臟器鏡下未見損傷，表明V2-LNCs和LNCs均具有良好的生物安全性。
　　4.結論
　　4.1 LNCs粒徑隨均值速度、超聲粉碎時間和功率增加而減小。
　　4.2 LNCs體外超聲顯影增強效果受粒徑大小和濃度高低的影響，篩選出粒徑為220 nm-450nm，濃度5 mg/mL的LNCs，體內實驗顯示良好的超聲顯影