單抗偶聯(lián)靶向超抗原SEA的制備及其體內(nèi)外抗膀胱癌實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、膀胱癌是我國(guó)泌尿系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,其中70％～80%是以復(fù)發(fā)和進(jìn)展為特征的非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌(NMIBC),標(biāo)準(zhǔn)的治療方案是經(jīng)尿道切除輔以膀胱灌注化療或免疫治療(如卡介苗BCG等)。然而當(dāng)前的膀胱灌注藥物不是療效有限,就是會(huì)引起嚴(yán)重的毒副作用;因此迫切需要一種新的膀胱灌注藥物。
　　 與BCG類似,超抗原SEA也是一種強(qiáng)大的T細(xì)胞激活劑,可對(duì)包括膀胱腫瘤在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生強(qiáng)大的MHCⅡ分子依賴的殺傷作用。但是由于僅有

2、很少一部分膀胱腫瘤細(xì)胞表達(dá)MHCⅡ分子,臨床單一應(yīng)用超抗原SEA灌注治療膀胱癌難以獲得滿意的療效。
　　 鑒于有研究顯示單抗靶向的超抗原不受上述限制,我們認(rèn)為灌注單抗靶向的超抗原SEA可能是一種更強(qiáng)大也更安全的治療SBC策略。因此本實(shí)驗(yàn)的目的旨在制備單抗靶向的超抗原SEA并在體內(nèi)外考察其抗膀胱腫瘤活性。
　　 1.單抗偶聯(lián)靶向超抗原SEA的制備及鑒定
　　 以木瓜蛋白酶、BDI-1抗體比率1:100制備的Fab段

3、與SEA以5倍抗體過(guò)量用SPDP偶聯(lián);經(jīng)surperdex-200柱純化:偶聯(lián)蛋白、Fab、SEA洗脫出峰時(shí)間分別為16、27.5、30 min;SDS-PAGE電泳顯示在250 kd出現(xiàn)連續(xù)條帶;免疫組化、免疫熒光顯示僅偶聯(lián)蛋白組膀胱癌細(xì)胞膜呈陽(yáng)性染色;CCK-8、ELISA法顯示偶聯(lián)蛋白促PBMC增殖指數(shù)PI、PBMC上清IL-2、TNF-α、IFN-γ濃度與SEA組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P≥0.05)。提示成功制備單抗偶聯(lián)靶向超抗原

4、SEA;并使其保持了良好的T細(xì)胞刺激活性和靶向活性。
　　 2.單抗偶聯(lián)靶向超抗原SEA對(duì)人膀胱癌細(xì)胞株BIU-87的抑制作用及機(jī)制研究
　　 試驗(yàn)分對(duì)照組、SEA組及單抗靶向SEA實(shí)驗(yàn)組,CCK-8法顯示單抗靶向SEA組細(xì)胞增殖抑制率顯著高于對(duì)照組及SEA組;熒光染色法、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示單抗靶向SEA組凋亡率顯著高于SEA組及對(duì)照組(P＜0.05);實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組均有上調(diào)Caspase3/7酶活性及Bax/Bcl-2

5、比值作用,其中單抗靶向SEA組顯著高于SEA組(P＜0.05)。而共培養(yǎng)上清中的IL-2、TNF-α、IFN-γ濃度單抗靶向SEA組與SEA組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。提示單抗靶向SEA較SEA對(duì)膀胱腫瘤細(xì)胞顯示出更強(qiáng)大的增殖抑制作用,這可能與其進(jìn)一步上調(diào)腫瘤細(xì)胞Bax/Bcl-2比值、增強(qiáng)Caspase3/7酶活性促進(jìn)其凋亡有關(guān)。
　　 3.人免疫重建荷人膀胱癌SCID小鼠復(fù)合模型的建立
　　 將預(yù)處理的SCI

6、D小鼠分空白分對(duì)照組、單純免疫重建組、單純荷瘤組及復(fù)合模型組,分別經(jīng)腹腔注射人淋巴細(xì)胞和(或)皮下接種BRJ87細(xì)胞建立相應(yīng)模型。SonoSite彩超顯示單純荷瘤組及復(fù)合模型組小鼠均可檢出膀胱癌皮下移植瘤,其體積隨時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增大,且兩組間差異顯著(P＜0.05);ELISA法、流式細(xì)胞術(shù)顯示單純免疫重建組及復(fù)合模型組小鼠外周血可檢出人IgG、人T淋巴細(xì)胞,其表達(dá)量也隨時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸提高;Real-time PCR及免疫組化顯示單

7、純荷瘤組及復(fù)合模型組小鼠脾臟、移植瘤中均可檢出人T淋巴細(xì)胞的表達(dá);而復(fù)合模型組小鼠外周血人T淋巴細(xì)胞的增殖、分泌活性及對(duì)膀胱癌細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)均與健康成人對(duì)照組差異無(wú)顯著性(P≥0.05)。提示成功建立了人免疫重建荷人膀胱癌SCID小鼠復(fù)合模型。
　　 4.單抗偶聯(lián)靶向超抗原SEA體內(nèi)抗膀胱腫瘤實(shí)驗(yàn)研究
　　 將人免疫重建荷人膀胱癌SCID小鼠分對(duì)照組、SEA組及單抗靶向SEA實(shí)驗(yàn)組,分別予以PBS、SEA及單抗靶向S