高通量測(cè)序分析乙肝疫苗接種失敗兒童及母親HBV全基因變異.pdf

1、目的:探討乙型肝炎病毒(HBV)母嬰傳播的特征，以及乙肝疫苗接種失敗兒童及母親HBV全基因變異情況。
　　方法:選擇8對(duì)重慶地區(qū)乙肝疫苗接種失敗的兒童及其慢性HBV攜帶母親，從血清中提取HBVDNA，應(yīng)用PCR方法擴(kuò)增HBV感染母子對(duì)的HBV基因組全長(zhǎng)，將HBV全基因組打斷成小的片段，并通過(guò)PCR反應(yīng)在每個(gè)樣本的5'端加上特有的Barcode序列，膠回收250bp～500bp的目的片段。將膠回收產(chǎn)物進(jìn)行solexa高通量測(cè)序，并對(duì)

2、測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。同時(shí)檢測(cè)HBV感染母子對(duì)乙肝兩對(duì)半、肝功能、HBVDNA等相關(guān)臨床指標(biāo)。
　　結(jié)果:(1)solexa測(cè)序平臺(tái)對(duì)HBV基因組測(cè)序的數(shù)據(jù)利用率約為39％，在HBV序列的nt900，nt1800和nt2600附近區(qū)域的測(cè)序深度低于其他區(qū)域。(2)HBV感染母子對(duì)之間的HBV全長(zhǎng)序列總相對(duì)香農(nóng)熵（TRE）可明顯聚類(lèi)，非母子對(duì)之間不能聚類(lèi);母子對(duì)HBV序列同源性為99％-100％。(3)8對(duì)母子HBV基

3、因型均為B+C混合型，其中6對(duì)優(yōu)勢(shì)基因型為B型，2對(duì)為C型，母子對(duì)優(yōu)勢(shì)基因型相同。(4)8例免疫失敗兒童在HBV全基因組各區(qū)段均有多態(tài)性顯著增高核苷酸位點(diǎn)，其中較集中的區(qū)域?yàn)镠BVS區(qū)的nt200-300和nt700-800，PreC區(qū)nt1814-1901，C區(qū)的nt1950-2100，P區(qū)的nt2650-2850。(5)所有兒童均在“a”決定簇存在多態(tài)性顯著增高位點(diǎn);8對(duì)母子中“a”決定簇區(qū)多態(tài)性顯著增高的氨基酸位點(diǎn)共有10個(gè)，僅存

4、在于兒童的有1個(gè)為aa143，僅存在于母親的有1個(gè)為aa124，發(fā)生優(yōu)勢(shì)氨基酸改變的位點(diǎn)有2個(gè)，分別為aa126位異亮氨酸突變?yōu)樘K氨酸(I126T)，和aa145位甘氨酸突變?yōu)榫彼?G145R)。
　　結(jié)論:高通量測(cè)序技術(shù)可以檢測(cè)HBV低頻率變異，母嬰宮內(nèi)傳播可能是兒童HBV感染的重要途徑，是乙肝疫苗接種失敗的重要原因，重慶地區(qū)HBV感染者以B型為主導(dǎo)，乙肝疫苗免疫失敗兒童的HBV全基因組各區(qū)段均有多態(tài)性顯著增高位點(diǎn)，“a”決定