Tim-3、Tim-4與系統(tǒng)性紅斑狼瘡發(fā)生的相關(guān)性研究.pdf

1、研究背景：
　　系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)是一種典型的慢性自身免疫性疾病,在我國(guó)發(fā)病率高、預(yù)后差。SLE的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜,其中凋亡細(xì)胞清除障礙是目前公認(rèn)的重要發(fā)病機(jī)制之一。Tim(T cell immunoglobulin domain andmucin-domain-containing molecule)是2001年新發(fā)現(xiàn)的免疫調(diào)節(jié)分子家族,它們?cè)谡{(diào)節(jié)過(guò)敏、哮喘、移植耐

2、受、自身免疫以及介導(dǎo)凋亡細(xì)胞清除中起重要作用。Tim分子具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu),其胞IgV區(qū)含有磷脂酰絲氨酸(Phosphatidylserine,PS)結(jié)合位點(diǎn),人類Tim家族的三個(gè)成員Tim-1、Tim-3和Tim-4都能夠識(shí)別PS。文獻(xiàn)報(bào)道,Tim-1僅表達(dá)于Th2細(xì)胞,不表達(dá)于吞噬細(xì)胞。Tim-3主要達(dá)在Th1細(xì)胞上,負(fù)性調(diào)節(jié)Th1細(xì)胞的免疫反應(yīng)。近來(lái)發(fā)現(xiàn)Tim-3也表達(dá)在固有免疫細(xì)胞如巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞,介導(dǎo)凋亡細(xì)胞的吞噬。Tim-

3、4選擇性表達(dá)于抗原提呈細(xì)胞,尤其高表達(dá)于巨噬細(xì)胞,能夠介導(dǎo)對(duì)凋亡細(xì)胞的攝取、吞噬和免疫耐受。已有研究表明,Tim-3分子的單個(gè)核苷酸多態(tài)性(SNP)易感于特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA),SLE患者Tim-3 mRNA表達(dá)水平高于正常人,但無(wú)顯著性差異,而SLE病人中Tim-4的mRNA表達(dá)水平顯著增高,提示Tim-3和Tim-4分子可能通過(guò)影響凋亡細(xì)胞吞噬參與SLE的發(fā)生。本課題首次從凋亡細(xì)胞清除障礙入手探討T

4、im-3和Tim-4分子在SLE發(fā)生中的作用及Tim-4的單個(gè)核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)與SLE發(fā)生的相關(guān)性。
　　目的：
　　檢測(cè)Tim-3和Tim-4在SLE單個(gè)核細(xì)胞中的表達(dá)水平;分析其表達(dá)水平與疾病活動(dòng)度的相關(guān)性以及Tim-4分子啟動(dòng)子區(qū)域-1419(rs6874202)、-1609(rs62382402)位點(diǎn)SNP與SLE發(fā)生的相關(guān)性。
　　方法：

5、r>　　1.檢測(cè)Tim-3和Tim-4分子在單個(gè)核細(xì)胞中的表達(dá)
　　1.1流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血CD14+細(xì)胞上Tim-3的表達(dá)
　　收集SLE患者和健康對(duì)照者的肝素抗凝血,破紅細(xì)胞,以熒光標(biāo)記的CD14、Tim-3抗體進(jìn)行染色,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Tim-3在外周血CD14+單核細(xì)胞上的表達(dá)。
　　1.2實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞上Tim-4 mRNA的表達(dá)
　　收集SLE患者的肝素抗凝血,分離患者外周血單個(gè)核

6、細(xì)胞(peripheral bloodmononuclear cells,PBMC)。用Trizol法抽提總RNA,逆轉(zhuǎn)錄成為cDNA后,用subgreen熒光探針?lè)ㄒ詫?shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)Tim-4 mRNA表達(dá)水平。
　　2.Annexin-V/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血細(xì)胞凋亡
　　收集SLE患者和健康對(duì)照者的肝素抗凝血,破紅細(xì)胞后,加入2ml冰預(yù)冷的PBS,1000rpm離心5min,棄去上清,加入PBS進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),

7、取2X105個(gè)細(xì)胞,離心后棄掉PBS,加入500μl凋亡檢測(cè)用緩沖液,混勻后,避光加入FITC標(biāo)記的Annexin-V2μl及PI2μl混勻,室溫避光孵育10min,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡的情況。
　　3.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Tim-3和Tim-4基因轉(zhuǎn)染的HEK293T細(xì)胞對(duì)凋亡細(xì)胞的吞噬作用
　　構(gòu)建人Tim-4真核表達(dá)載體pcDNA3.0-hTim-4。小鼠胸腺細(xì)胞以10μmol/L地塞米松于無(wú)血清培養(yǎng)基孵育4h誘導(dǎo)胞凋亡,

8、并用Phrodo-SE進(jìn)行標(biāo)記。利用脂質(zhì)體將pcDNA3.0-hTim-3和pcDNA3.0-hTim-4轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞,轉(zhuǎn)染24h后,與凋亡的胸腺細(xì)胞以1:10比例混合于37℃孵育90min,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)胸腺細(xì)胞的凋亡率及HEK293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后對(duì)凋亡細(xì)胞的吞噬情況。
　　4.PCR和測(cè)序分析Tim-4基因啟動(dòng)子區(qū)域-1419(rs6874202)和-1609(rs62382402)兩位點(diǎn)基因多態(tài)性
　　收集1

9、79例SLE患者和168例健康對(duì)照者的肝素抗凝血,用血液基因組提取試劑盒抽取外周血DNA,用PCR擴(kuò)增含有Tim-4基因-1419(rs6874202)和-1609(rs62382402)位點(diǎn)的600bp基因片段,然后將PCR產(chǎn)物送到公司純化并測(cè)序。測(cè)序結(jié)果經(jīng)Blast比對(duì)分析,確定-1419(rs6874202)和-1609(rs62382402)位點(diǎn)的基因型,計(jì)算基因型及等位基因頻率。
　　5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　運(yùn)用Gra

10、phPad Prism5軟件來(lái)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行了Mann-Whitney非參數(shù)U檢驗(yàn)、one-way ANOVA分析和Spearman相關(guān)性分析。采用SPSSl3.0軟件包進(jìn)行Hardy-weinberg平衡定律和卡方檢驗(yàn)。認(rèn)為P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.SLE患者外周血細(xì)胞凋亡水平顯著高于健康對(duì)照組,而且細(xì)胞凋亡率與補(bǔ)體3(C3)呈負(fù)相關(guān),與SLE疾病活動(dòng)度(SLEDAI)呈正相關(guān)。
　　流式結(jié)果顯

11、示,SLE患者外周血Annexin-V/PI雙標(biāo)中Annexin-V+細(xì)胞的百分率即細(xì)胞凋亡水平(31.14%±11.3%)顯著高于健康對(duì)照組(17.57%±6.94%)(P＜0.0001)。經(jīng)Spearman相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)SLE患者外周血細(xì)胞凋亡水平與C3水平呈良好負(fù)相關(guān)(P:0.0171,r=-0.5692),與SLEDAI評(píng)分呈正相關(guān)(P=0.0408,r=0.3635),與dsDNA和C4沒(méi)有相關(guān)性。高水平的抗雙鏈DNA抗體(

12、anti-dsDNA)、低水平的C3、C4和疾病活動(dòng)性相一致。
　　2.SLE患者外周血CD14+細(xì)胞上Tim-3的表達(dá)水平在疾病活動(dòng)期(SLEDAI＞5)高于健康對(duì)照組,且與anti-dsDNA呈正相關(guān)。
　　流式結(jié)果顯示,處于活動(dòng)期的SLE患者(SLEDAI＞5)CD14+細(xì)胞上Tim-3的表達(dá)水平(58.62%/±19.58%)顯著高于健康對(duì)照組(41.96%±21.97%)(P=0.0265)。但是在疾病非活動(dòng)期CD

13、4+細(xì)胞上Tim-3的表達(dá)水平與健康對(duì)照組以及疾病活動(dòng)期都沒(méi)有明顯差別。另外,SLE患者CD14+細(xì)胞上Tim-3的表達(dá)水平與anti-dsDNA成正相關(guān)(p=0.0471,r=0.4379),與C3、C4和SLEDAI評(píng)分沒(méi)有相關(guān)性。
　　3.SLE患者外周血細(xì)胞凋亡水平與CD14+細(xì)胞上Tim-3的表達(dá)水平呈正相關(guān)。
　　流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示,SLE患者外周血細(xì)胞凋亡水平與CD14+細(xì)胞上Tim-3的表達(dá)水平呈良好正相

14、關(guān)(P=O.0338,r=0.3762)。
　　4.SLE患者外周血PBMC Tim-4 mRNA表達(dá)水平與臨床指標(biāo)無(wú)明顯的相關(guān)性。
　　SLE患者中外周血PBMC Tim-4 mRNA表達(dá)水平與凋亡水平、anti-dsDNA、C3、C4、SLEDAI評(píng)分并沒(méi)有相關(guān)性。
　　5.Tim-3和Tim-4促進(jìn)HEK293T細(xì)胞對(duì)凋亡細(xì)胞的吞噬。
　　將pcDNA3.0-Tim-3和pcDNA3.0-Tim-4轉(zhuǎn)染HE

15、K293T細(xì)胞后并與凋亡的胸腺細(xì)胞共孵育,與轉(zhuǎn)染pcDNA3.0的HEK293T細(xì)胞的吞噬率(6.4%)相比,發(fā)現(xiàn)Tim-3和Tim-4能夠明顯促進(jìn)HEK293T細(xì)胞對(duì)凋亡細(xì)胞的吞噬作用(Tim-3:15.8%;Tim-4:14.0%)。
　　6.Tim-4基因-1419(rs6874202)位點(diǎn)為GG基因型的SLE患者dsDNA水平和外周血細(xì)胞凋亡水平分別顯著高于GA/AA和GA基因型,而GG基因型的患者C3水平顯著低于AA基因

16、型。
　　測(cè)序結(jié)果顯示,SLE患者和健康對(duì)照組Tim-4-1419(rs6874202)和-1609(rs62382402)位點(diǎn)基因型分布和等位基因分布沒(méi)有差別。Tim-4-1419(rs6874202)位點(diǎn)GG基因型的SLE患者外周血anti-dsDNA顯著高于GA及AA基因型的患者(P=-0.0335),而GG和GA基因型的SLE患者C3水平顯著低于AA基因型(p=0.0187),另外,發(fā)現(xiàn)AA和GG基因型的SLE患者細(xì)胞凋亡

17、水平顯著高于GA基因型的患者(p=0.0393)。
　　結(jié)論：
　　1.SLE患者細(xì)胞凋亡水平明顯高于對(duì)照組,CD14+細(xì)胞上Tim-3的表達(dá)水平在疾病活動(dòng)期高于健康對(duì)照。
　　2.SLE患者外周血細(xì)胞凋亡水平與C3呈負(fù)相關(guān),與SLEDAI評(píng)分呈正相關(guān),患者CD14+細(xì)胞上Tim-3的表達(dá)水平與anti-dsDNA及細(xì)胞凋亡水平呈良好正相關(guān),提示Tim-3分子可能與SLE患者的凋亡細(xì)胞清除障礙有關(guān)。
　　3.中國(guó)

18、人群中存在Tim-4基因啟動(dòng)子區(qū)-1419/-1609 G/A突變,且-1419位點(diǎn)GG基因型的SLE患者外周血anti-dsDNA和凋亡水平分別顯著高于GA/AA和GA基因型的患者,而GG基因型的患者C3水平顯著低于AA基因型,雖然未發(fā)現(xiàn)Tim-4基因啟動(dòng)子區(qū)-1419/-1609位點(diǎn)SNP與SLE發(fā)生的相關(guān)性,但是-1419位點(diǎn)的GG基因型可能會(huì)影響SLE的病程進(jìn)展和預(yù)后。
　　創(chuàng)新點(diǎn)及意義：
　　本研究首次發(fā)現(xiàn)SLE患