魚類爛鰓病病原柱狀黃桿菌基因工程疫苗的研究.pdf

1、柱狀黃桿菌（Flavobacterium columnare）是一種革蘭氏陰性細(xì)菌，是引起魚類柱形?。–olumnaris disease）的病原。該菌能感染多種淡水性魚類，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，主要依靠使用化學(xué)藥物對柱形病進(jìn)行預(yù)防和治療，然而藥物的大量使用會導(dǎo)致水產(chǎn)品藥物殘留的食品安全問題，以及對水生態(tài)系統(tǒng)的影響和耐藥菌株的出現(xiàn)等問題。開展柱狀黃桿菌基因工程疫苗的研究將為柱形病的防治提供新思路和更為有效的方法。

2、　　細(xì)菌的外膜蛋白是細(xì)菌與宿主相互作用的界面，容易被宿主識別而引起機體的免疫反應(yīng)，因此被認(rèn)為是制備抗原的良好材料。利用雙向電泳(2-DE)并結(jié)合免疫印跡的方法，在柱狀黃桿菌外膜蛋白中篩選到5個免疫原性蛋白，經(jīng)基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF/TOF MS）鑒定，它們是:gliding motilitylipoprotein GldJ(GldJ)、hypothetical protein FCOL_09735(fcol

3、)、F0F1 ATP synthasesubunit beta(f0n)、lipoprotein(lip)和outer membrane efflux protein precursor（omepp）。將這5個免疫原性蛋白基因進(jìn)行PCR擴增后，與原核表達(dá)載體pET28a連接，分別構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a-gldJ、pET28a-fcol、pET28wlip、pET28a-f0f1和pET28a-omepp。然后，將這些質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入

4、大腸桿菌（Escherichia coli）BL21感受態(tài)細(xì)胞，并通過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)相應(yīng)的蛋白。將純化后的蛋白免疫草魚，草魚體內(nèi)產(chǎn)生了特異性的抗體，而且一些免疫相關(guān)基因的表達(dá)也有上調(diào)，這些基因包括Interleukin1β(IL-1β)、IL-8和IL-10,IFN-Ⅰ和 IFN-γ、Immunoglobulin M(IgM)、IgD、IgZ、Major histocompatibility complexⅠ(MHCⅠα)和MHCⅡβ

5、、C-reactive protein(CRP)。這5個重組蛋白，rgldJ、rfcol、rf0f1、rlip和romepp對用柱狀黃桿菌攻毒后草魚的免疫保護(hù)率依次為72％、8％、32％、64％和68％。且rgldJ、rlip和romepp蛋白免疫組的草魚血清對柱狀黃桿菌的生長有顯著的抑制作用。這些實驗結(jié)果表明這3個基因是柱狀黃桿菌的保護(hù)性抗原基因，可以作為制備柱狀黃桿菌基因工程疫苗的候選抗原。
　　另一方面，毒力因子被認(rèn)為是很好

6、的疫苗候選基因。為了提高免疫原性和增強保護(hù)效果，將柱狀黃桿菌的5個可能的毒力因子基因，鋅蛋白酶、脯氨酸寡肽酶、嗜熱蛋白酶、膠原酶和硫酸軟骨素AC裂解酶的抗原片段進(jìn)行融合，構(gòu)建了它們的融合復(fù)合體的原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a-zptcc，并表達(dá)了相應(yīng)的融合蛋白。將純化后的融合蛋白免疫草魚，發(fā)現(xiàn)草魚血清中出現(xiàn)了特異性抗體，且免疫后草魚血清中IL-1β、IL-8、IL-10、IgM、IFN-Ⅰ、CRP和MHCⅠα等基因出現(xiàn)顯著上調(diào)，而且該融合蛋白