肺炎鏈球菌毒力蛋白基因工程疫苗的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景與目的：
　　 肺炎鏈球菌是社區(qū)獲得性感染最常見(jiàn)的致病菌,全球每年有超過(guò)100萬(wàn)兒童死于肺炎鏈球菌感染性疾病。目前肺炎鏈球菌對(duì)抗生素多重耐藥情況日趨嚴(yán)重,使肺炎鏈球菌感染的治療面臨重大挑戰(zhàn),WHO提出應(yīng)用疫苗預(yù)防肺炎鏈球菌感染是減少耐藥菌傳播、緩解抗生素耐藥壓力,保護(hù)高危人群的唯一方法。
　　 國(guó)內(nèi)外越來(lái)越多的臨床研究發(fā)現(xiàn)目前應(yīng)用的肺炎鏈球菌23價(jià)莢膜多糖疫苗和7價(jià)蛋白-多糖結(jié)合疫苗存在血清型依賴,成本昂貴,不降低肺

2、炎鏈球菌鼻咽部攜帶等不足。研發(fā)新一代非血清型依賴的安全、便攜、廉價(jià)的新型肺炎鏈球菌疫苗具有巨大的經(jīng)濟(jì)效益和深遠(yuǎn)的社會(huì)價(jià)值。
　　 肺炎鏈球菌作為條件致病菌,多種毒力因子獨(dú)立或協(xié)同的參與了其粘附、定植、遷移、侵襲性致病的全過(guò)程?；诜窝祖溓蚓嚓P(guān)毒力蛋白的DNA疫苗具有非血清型依賴、覆蓋率廣、造價(jià)低廉等優(yōu)勢(shì),成為第三代肺炎鏈球菌疫苗的研究熱點(diǎn)。
　　 靶抗原的選擇,優(yōu)勢(shì)載體系統(tǒng)的應(yīng)用和理想的接種途徑是新型肺炎鏈球菌DNA疫

3、苗研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本課題組前期研究已經(jīng)證實(shí)了肺炎鏈球菌表面蛋白A(pneumococcal surface protein A,PspA)及肺炎鏈球菌黏附素A(pneumococcal surfaceadhesion A,PsaA)的聯(lián)合是最優(yōu)勢(shì)的候選抗原組合形式,但是傳統(tǒng)的DNA疫苗免疫途徑并不具備激發(fā)鼻咽部特異性sIgA抗體保護(hù)的能力,而且免疫原性較弱。鑒于鼻咽部定植是肺炎鏈球菌感染的首要步驟,研究如何優(yōu)化DNA疫苗的載體系統(tǒng),選擇

4、理想的免疫途徑進(jìn)而增強(qiáng)肺炎鏈球菌DNA疫苗的免疫效能,尤其是增加其鼻咽部粘膜免疫保護(hù)效能具有重要意義。
　　 因此,本課題圍繞“肺炎鏈球菌基因工程疫苗的實(shí)驗(yàn)研究”,進(jìn)行了以下三部分研究工作:(1)第一部分:基于優(yōu)勢(shì)靶抗原組合(pspaA+psaA基因),構(gòu)建肺炎鏈球菌多價(jià)DNA疫苗。復(fù)制肺炎鏈球菌鼻咽部攜帶及腹腔攻擊動(dòng)物模型,裸質(zhì)粒肌肉注射方式免疫接種,評(píng)價(jià)其免疫原性及保護(hù)效能;(2)第二部分:基于載體一宿主致死平衡原理,設(shè)計(jì)改

5、造現(xiàn)有減毒沙門菌為宿主菌的沙門菌-原核質(zhì)粒平衡致死系統(tǒng),將其攜帶的原核質(zhì)粒改造為非抗性基因篩選的真核質(zhì)粒,構(gòu)建新型減毒沙門菌為載體的多價(jià)肺炎鏈球菌DNA基因工程疫苗,復(fù)制肺炎鏈球菌鼻咽部攜帶及腹腔攻擊動(dòng)物模型,經(jīng)口服途徑免疫接種,評(píng)價(jià)其穩(wěn)定性、免疫原性及免疫保護(hù)效能;(3)第三部分:進(jìn)一步利用基因組學(xué)及分子遺傳學(xué)技術(shù)針對(duì)優(yōu)勢(shì)靶抗原進(jìn)行分子進(jìn)化及比較基因組學(xué)的初步研究。旨在為肺炎鏈球菌新一代基因工程疫苗的研發(fā)提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

6、r>　　 方法:
　　 1.分子克隆技術(shù)構(gòu)建PsaA和PspA'(PspA的N端抗原表位所在區(qū)域基因片段)的重組真核表達(dá)質(zhì)粒PsaA-pcDNA3.1和PspA'-pcDNA3.1。兩種重組質(zhì)粒DNA疫苗PsaA-pcDNA3.1和PspA'-pcDNA3.1裸質(zhì)粒單獨(dú)或聯(lián)合肌肉注射免疫小鼠,ELISA檢測(cè)免疫小鼠脾細(xì)胞分泌細(xì)胞因子及血清中特異性抗體IgG水平;復(fù)制小鼠肺炎鏈球菌D39株鼻咽部攜帶和腹腔侵襲性感染模型,觀察免疫

7、小鼠鼻咽部肺炎鏈球菌攜帶改變和腹腔攻擊小鼠21天生存情況。
　　 2.新型減毒沙門菌為載體的多價(jià)肺炎鏈球菌DNA疫苗構(gòu)建及其穩(wěn)定性、免疫效能檢測(cè)。
　　 (1)肺炎鏈球菌DNA疫苗的新型減毒沙門菌載體系統(tǒng)構(gòu)建:基于pcDNA3.1(+),應(yīng)用.BspHI、Xmn I雙酶切獲得片段SV400ri-Neor-SV40Pa-pLICori和Pcmv-MCS-BGHpA-flori,再用SalⅠ酶切SV400ri-Neor-SV

8、40pA-pIJCori獲得片段pUCori;將酶切獲得的pUCori、Pcmv-MCS-BGHpA-flori兩個(gè)片段及變形鏈球菌asd基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行連接,構(gòu)建新互補(bǔ)質(zhì)粒pcDNA3.1000,并最終轉(zhuǎn)化入宿主菌沙門菌x4550中(pcDNA3.1000x)。
　　 (2)分子克隆技術(shù)構(gòu)建新型減毒沙門菌為載體的肺炎鏈球菌DNA疫苗pcDNA3.1001x(編碼pspA'基因)和pcDNA3.1002x(編碼psaA基因

9、),并檢測(cè)重組質(zhì)粒在哺乳動(dòng)物細(xì)胞BHK-21中的表達(dá)(RT-PCR及Western-blot)及質(zhì)粒穩(wěn)定性。新型減毒沙門菌為載體的肺炎鏈球菌DNA疫苗pcDNA3.1001x和pcDNA3.1002x單獨(dú)或聯(lián)合口服免疫小鼠,ELISA檢測(cè)免疫小鼠脾細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子、血清中特異性抗體IgG及鼻咽部灌洗液中sIgG水平。復(fù)制小鼠肺炎鏈球菌D39株鼻咽部攜帶模型和腹腔侵襲性感染模型,觀察免疫小鼠鼻咽部肺炎鏈球菌D39菌落計(jì)數(shù)改變和腹腔攻擊小

10、鼠21天生存情況,以評(píng)價(jià)新型減毒沙門菌為載體的多價(jià)肺炎鏈球菌DNA疫苗的免疫原性及保護(hù)作用優(yōu)勢(shì)。
　　 3.采用分子遺傳學(xué)技術(shù)進(jìn)一步分析肺炎鏈球菌基因工程疫苗優(yōu)勢(shì)抗原蛋白的分子進(jìn)化特點(diǎn)及抗原多樣性。
　　 (1)采集上呼吸道共棲環(huán)境中的臨床收集輕鏈球菌家族菌株(包含肺炎鏈球菌、輕鏈球菌、口腔鏈球菌、血鏈球菌、嬰兒鏈球菌),PCR技術(shù)探查psaA基因分布情況?；跀U(kuò)增的psaA基因進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)構(gòu)建,分析p

11、saA的序列特點(diǎn)及在輕鏈球菌家族中可能的遺傳機(jī)制。
　　 (2)采集本地區(qū)臨床致病肺炎鏈球菌感染菌株,應(yīng)用PspA蛋白家族分型特異性引物PCR及生物信息學(xué)技術(shù)鑒定本地區(qū)臨床自然感染肺炎鏈球菌株P(guān)spA家族分布特點(diǎn);進(jìn)一步應(yīng)用分子遺傳學(xué)技術(shù)構(gòu)建pspA基因多家族的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù),分析肺炎鏈球菌PspA作為新一代肺炎鏈球菌基因工程疫苗優(yōu)勢(shì)候選抗原應(yīng)包含的優(yōu)勢(shì)家族成分。
　　 結(jié)果:
　　 1.肺炎鏈球菌多價(jià)DNA疫苗的構(gòu)

12、建:成功擴(kuò)增pspA基因包含抗原表位的N端片段及psaA基因目標(biāo)片段,分別克隆入真核載體pcDNA3.1(+),構(gòu)建了PspA'-pcDNA3.1和PsaA-pcDNA3.1兩種肺炎鏈球菌毒力蛋白重組真核質(zhì)粒,并從轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平檢測(cè)了這兩種重組質(zhì)粒編碼的psaA及pspA'基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞的成功表達(dá)。
　　 2.肺炎鏈球菌多價(jià)DNA疫苗的免疫原性及保護(hù)效能
　　 2.新型減毒沙門菌為載體的肺炎鏈球菌多價(jià)DNA疫苗免

13、疫原性及保護(hù)效能
　　 3.肺炎鏈球菌新一代基因工程疫苗優(yōu)勢(shì)靶抗原PsaA、PspA在鼻咽部微環(huán)境共棲同種群細(xì)菌中的分子遺傳學(xué)分析
　　 (1)肺炎鏈球菌psaA基因的種群基因起源進(jìn)化分析提示psaA基因在臨床分離的輕鏈球菌群菌株中廣泛存在,但是僅僅在肺炎鏈球菌中該基因是垂直遺傳的,其它的輕鏈球菌群菌株中psaA基因可能來(lái)源于共生環(huán)境中基因的水平轉(zhuǎn)移,并且推測(cè)這些轉(zhuǎn)移的psaA基因之間的差異可能與BOX元件的參與及轉(zhuǎn)移后

14、發(fā)生的頻繁的基因內(nèi)重組現(xiàn)象相關(guān)。
　　 (2)肺炎鏈球菌pspA基因N端抗原多樣性區(qū)域基因組學(xué)分析提示本地區(qū)PspA蛋白家族分布趨勢(shì):PspA-Faml-Clade2(31.0％)和PspA-Fam2-Clade3(47.6％)的菌株作為優(yōu)勢(shì)分布,與國(guó)外報(bào)道存在差異。
　　 結(jié)論:
　　 新型減毒沙門菌載體系統(tǒng)在保障重組質(zhì)粒的穩(wěn)定性同時(shí)避免了抗性基因及減毒株毒力回復(fù)的安全問(wèn)題,將其應(yīng)用于攜帶肺炎鏈球菌多價(jià)DNA疫

15、苗,激發(fā)了機(jī)體更全面的全身性免疫應(yīng)答,在肺炎鏈球菌的定植及侵襲性感染的動(dòng)物模型中表現(xiàn)出了增強(qiáng)的保護(hù)效能,是一種具備良好應(yīng)用前景的肺炎鏈球菌基因工程疫苗優(yōu)化策略。
　　 肺炎鏈球菌基因工程疫苗的優(yōu)勢(shì)靶抗原psaA和pspA基因的抗原遺傳背景分析證實(shí)了這兩種抗原在肺炎鏈球菌的抗原特異性。但pspA基因在本地區(qū)肺炎鏈球菌株中的抗原多樣性現(xiàn)象提示:在進(jìn)一步的肺炎鏈球菌基因工程疫苗靶抗原優(yōu)化策略中應(yīng)包含PspA優(yōu)勢(shì)家族抗原表位才能更全面的