柱狀黃桿菌(Flavobacterium columnare)菌蛻疫苗的研究.pdf

1、柱狀黃桿菌(Flavobacterium columnare)是革蘭氏陰性的能滑動的需氧桿菌,是柱形病(columnaris disease,CD)的重要病原菌,能感染多種經(jīng)濟魚類引發(fā)高死亡率,從而給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大經(jīng)濟損失.該菌在水環(huán)境中廣泛分布,可以引起野生魚類、養(yǎng)殖魚類甚至是玻璃缸中的觀賞魚類等發(fā)病,其菌感染引發(fā)的爛鰓病和出血病是魚類柱形病的典型病癥.病患魚體爛鰓、鰭條腐爛脫落及體表潰瘍出血等惡性癥狀加速了病原菌的增殖與交叉感染

2、。很多報道己經(jīng)證明使用化學(xué)藥物如各種消毒劑或抗生素是治療柱形病的一種重要手段,然而這些藥物的大量使用導(dǎo)致了耐藥性病原菌的出現(xiàn),并對環(huán)境和人類產(chǎn)生了負(fù)面影響,存在著很大的風(fēng)險性,致使疫苗免疫逐漸成為一種越來越重要的防治策略。用甲醛滅活或熱滅活的柱狀黃桿菌制劑防治柱形病的嘗試表明通過浸泡或注射這些制劑不能為免疫魚提供免疫保護或僅提供部分保護.而美國農(nóng)業(yè)部研制的柱狀黃桿菌減毒活疫苗雖然能有效的防治柱狀黃桿菌的感染,但由于其疫苗包含著活菌,存在

3、著毒力返強和與野毒株發(fā)生重組導(dǎo)致新毒株出現(xiàn)的危險。因此,為了更好的預(yù)防和控制柱形病的發(fā)生,亟須開發(fā)一種安全、高效、經(jīng)濟的新型柱狀黃桿菌疫苗。細(xì)菌菌蛻(Bacterial Ghosts，BGs)是革蘭氏陰性菌被噬菌體PhiX174的裂解蛋白E裂解后形成的完整細(xì)菌空殼,其完好的保留了與活菌一致的細(xì)菌表面的各種抗原性成分和免疫粘附分子。由于菌蛻具有優(yōu)良的免疫原性、固有免疫佐劑特性以及免疫系統(tǒng)靶向性,能夠誘導(dǎo)更強的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng),因此其作為

4、制備非活性疫苗的新策略越來越受到重視.本研究首次報道了柱狀黃桿菌菌蛻的制備及其對草魚的較強免疫保護作用。
　　本研究以柱狀黃桿菌強毒株F.columnare G4R3為研究對象,分析了其生化特性、生長特性、耐藥性等生物學(xué)特性,根據(jù)已報道菌株的16S rDNA序列設(shè)計了一對特異性引物進(jìn)行PCR鑒定,以我國重要的淡水魚類經(jīng)濟品種草魚(Ctenopharyngodon idellus)為實驗動物測定了F. columnare G4R3的

5、半致死濃度并檢測了其對草魚的感染致病力。F. columnare G4R3在26℃能夠很好的生長,為通過升溫誘導(dǎo)其菌蛻的產(chǎn)生提供了保障.F. columnare G4R3對氯霉素和頭孢菌素類有較高的敏感性,而對氨芐青霉素、卡那霉素等有較低的敏感性,表明氯霉素可以作為裂解質(zhì)粒的遺傳篩選標(biāo)記。F. columnare G4R3對草魚腹腔注射的半致死劑量約為3.1×105 CFU,應(yīng)用約5倍半致死劑量對草魚進(jìn)行攻毒試驗,100％的草魚發(fā)病,8

6、0％以上的草魚死亡,為后續(xù)草魚的免疫和攻毒保護試驗奠定了基礎(chǔ)。菌蛻制備的核心是對裂解基因geneE的穩(wěn)定抑制和可控轉(zhuǎn)錄表達(dá).基于溫控質(zhì)粒 pBV220,構(gòu)建了溫控裂解質(zhì)粒:氨芐抗性裂解質(zhì)粒 pBV-geneE、源于質(zhì)粒pLysS氯霉素抗性的裂解質(zhì)粒pBV-geneE-cat和源于柱狀黃桿菌乙酰輔酶A合成酶啟動子及調(diào)控序列的氯霉素抗性裂解質(zhì)粒pBV-geneE-Fpro-cat;基于IPTG誘導(dǎo)的pET系統(tǒng),構(gòu)建了IPTG誘導(dǎo)的融合蛋白表

7、達(dá)的裂解質(zhì)粒:卡那抗性pET28a-geneE、氨芐抗性pET32a-geneE、源于質(zhì)粒 pLysS氯霉素抗性的pET28a-geneE-cat與pET32a-geneE-cat.通過對F. columnare G4R3的轉(zhuǎn)化均尾篩選到陽性轉(zhuǎn)化子,提示菌株可能存在著某些限制外源質(zhì)粒進(jìn)入菌體或在菌體內(nèi)穩(wěn)定復(fù)制和表達(dá)的遺傳屏障。
　　本文對F.columnare G4R3菌株的限制性遺傳屏障的研究發(fā)現(xiàn)：F.columnare G4R

8、3不僅具有較強降解活性的核酸酶,還存在著一個內(nèi)源性質(zhì)粒(命名為FcG4P).對質(zhì)粒 FcG4P的全序列解析僅發(fā)現(xiàn)一個與質(zhì)粒復(fù)制起始相關(guān)的區(qū)域.將 F. columnare G4R3通過十二烷基磺酸鈉、吖啶橙及溴化乙錠非定向誘變?nèi)コ|(zhì)粒FcG4P,通過PCR大規(guī)模的篩選獲得了去除內(nèi)源性質(zhì)粒的穩(wěn)定衍生菌株 F.columnare G4R3M.通過氯霉素抗性裂解質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化試驗,成功篩選到一株含溫控裂解質(zhì)粒的衍生菌株F. columnare G

9、4R3M22.F.columnare G4R3M22(pBV-geneE-Fpro-cat)可通過升高培養(yǎng)溫度至42℃來誘導(dǎo)裂解基因 E的表達(dá),從而形成菌蛻.在誘導(dǎo)裂解過程中,F. columnare G4R3M22的裂解過程比較緩慢,需要持續(xù)約10 h才能完成。F.columnare G4R3M22菌蛻(FCG)中遺傳物質(zhì)進(jìn)行電泳分析檢測不到基因組DNA的存在,表明其是比較安全的。掃描電鏡和透射電鏡觀察顯示FCG的裂解孔道主要位于菌體

10、的兩極或中間,并且菌體內(nèi)不含內(nèi)容物,進(jìn)一步表明柱狀黃桿菌菌蛻制備成功。應(yīng)用FCG腹腔注射免疫健康草魚,草魚的血清凝集效價和血清殺菌活性顯著升高,在二免后2周達(dá)到最高,隨后呈下降趨勢.對免疫草魚用母源強毒株 F. columnare G4R3進(jìn)行攻毒,結(jié)果表明FCG能誘導(dǎo)草魚產(chǎn)生較強的免疫反應(yīng)和免疫保護,相對百分存活率達(dá)到70.9％,顯著高于甲醛滅活苗組的相對百分存活率41.9％。綜上所述,本研究以F. columnare G4R3為研究

11、對象,通過分析F. columnare G4R3的生物學(xué)特性,構(gòu)建了帶有氯霉素抗性篩選標(biāo)記的溫控裂解質(zhì)粒,通過分析柱狀黃桿菌的限制性遺傳屏障和非定性誘變篩選,獲得了一株能接納氯霉素抗性溫控裂解質(zhì)粒的柱狀黃桿菌衍生株F. columnare G4R3M22.通過對F. columnare G4R3M22(pBV-geneE-Fpro-cat)的誘導(dǎo)調(diào)控,首次實現(xiàn)了柱狀黃桿菌菌蛻的成功制備,對該菌蛻免疫效力的評價試驗表明其能誘導(dǎo)草魚產(chǎn)生較強