Nrf2-ARE信號(hào)通路參與小細(xì)胞肺癌多藥耐藥相關(guān)蛋白1的表達(dá)調(diào)控.pdf

1、第一部分 Nrf2促進(jìn)人耐藥肺小細(xì)胞癌細(xì)胞H69AR的耐藥
　　目的:明確Nrf2對(duì)人耐藥肺小細(xì)胞癌細(xì)胞H69AR的耐藥影響。
　　方法:選用兩株耐藥性不同的肺小細(xì)胞癌腫瘤細(xì)胞株:藥物敏感型細(xì)胞株H69和耐藥株H69AR，應(yīng)用realtime PCR及Western方法比較Nrf2，MRPs及Ⅱ相解毒酶的表達(dá)差異;應(yīng)用MTT檢測(cè)兩株細(xì)胞的藥物敏感性差異;采用Nrf2 siRNA雙鏈寡核苷酸干擾耐藥肺小細(xì)胞癌H69AR細(xì)胞;隨

2、后應(yīng)用Western方法檢測(cè)H69AR細(xì)胞干擾前后Nrf2，MRP1的表達(dá)差異;應(yīng)用MTT檢測(cè)耐藥株H69AR細(xì)胞在Nrf2干擾前后藥物敏感性的差異。
　　結(jié)果:相對(duì)于H69細(xì)胞，H69AR細(xì)胞中Nrf2及Mrp1 mRNA及蛋白均高表達(dá)，且耐藥性隨著Nrf2、Mrp1表達(dá)的增高而耐藥性增強(qiáng)。Nrf2 siRNA干擾后，可以下調(diào)肺小細(xì)胞癌耐藥株H69AR細(xì)胞內(nèi)Mrp1的蛋白表達(dá)，同時(shí)相對(duì)干擾前，H69AR細(xì)胞對(duì)化療藥物由耐藥變?yōu)槊?/p>

3、感。
　　小結(jié):Nrf2可以通過上調(diào)人耐藥肺小細(xì)胞癌細(xì)胞H69AR細(xì)胞內(nèi)的MRP1蛋白的表達(dá)，促進(jìn)其耐藥。
　　第二部分 Nrf2通過直接與Mrp1基因啟動(dòng)子區(qū)的ARE位點(diǎn)結(jié)合，促進(jìn)Mrp1的表達(dá)
　　目的:探索Nrf2-ARE通路如何調(diào)控Mrp1基因表達(dá)，明確Mrp1是否為Nrf2的下游靶基因。
　　方法:在人Mrp1基因5'啟動(dòng)子區(qū)域，搜尋可能的ARE序列?；瘜W(xué)合成野生型ARE序列以及針對(duì)ARE序列上的關(guān)鍵位

4、點(diǎn)進(jìn)行點(diǎn)突變;構(gòu)建相應(yīng)的ARE野生型熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，及ARE突變型螢光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)染至MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)，觀察Nrf2刺激后的熒光素酶活性的改變。設(shè)計(jì)針對(duì)Mrp1基因啟動(dòng)子區(qū)域ARE序列的引物，通過染色體免疫共沉淀法，明確轉(zhuǎn)錄因子Nrf2與Mrp1啟動(dòng)子區(qū)的ARE位點(diǎn)直接結(jié)合。
　　結(jié)果:在人Mrp1基因5'啟動(dòng)子區(qū)域，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)可能的ARE位點(diǎn)，被命名為ARE1及ARE2。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)提示過表達(dá)Nr

5、f2可增加ARE1及ARE2介導(dǎo)的啟動(dòng)子活性的誘導(dǎo)，而突變型ARE1及ARE2則降低了Nrf2誘導(dǎo)的啟動(dòng)子活性。231細(xì)胞染色體免疫共沉淀顯示，在tBHQ刺激誘導(dǎo)核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2高表達(dá)后，這些過表達(dá)的Nrf2轉(zhuǎn)錄因子隨即被招募至Mrp1基因啟動(dòng)子區(qū)的ARE1及ARE2位點(diǎn)。同時(shí)，比較CHIP實(shí)驗(yàn)證實(shí)，與H69細(xì)胞相比，H69AR細(xì)胞中與ARE1及ARE2結(jié)合的Nrf2更多。
　　小結(jié):Mrp1基因啟動(dòng)子區(qū)發(fā)現(xiàn)ARE1及ARE2位

6、點(diǎn)。核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2可以與Mrp1基因的ARE1及ARE2位點(diǎn)直接結(jié)合。Mrp1為Nrf2靶基因。
　　第三部分人癌組織中Nrf2，NQO1及Mrp1的表達(dá)及其相互關(guān)系
　　目的:闡明人小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、胃癌、大腸癌組織中Nrf2，NQO1及Mrp1的表達(dá)以及三者的相關(guān)性。
　　方法:采用IHC的方法檢測(cè)40例人癌組織標(biāo)本（小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、胃癌、大腸癌組織各10例）中Nrf2、NQO1及Mrp1的表達(dá);IHC染

7、色切片應(yīng)用i-Solution軟件將三者在癌組織中的表達(dá)進(jìn)行分析和定量;Pearson's相關(guān)分析比較三者表達(dá)的兩兩相關(guān)性。
　　結(jié)果:Nrf2蛋白主要為細(xì)胞胞核內(nèi)表達(dá)，細(xì)胞漿內(nèi)有部分表達(dá)。MRP1在胞漿和胞膜均有表達(dá)，而NQO1主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)中;染色數(shù)據(jù)和統(tǒng)計(jì)分析顯示，三個(gè)指標(biāo)在癌組織中的表達(dá)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于癌旁組織;MRP1的表達(dá)與Nrf2有很強(qiáng)的相關(guān)性，經(jīng)Pearson's相關(guān)分析，兩者之間的相關(guān)系數(shù)在小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、胃癌及大