MAD2蛋白在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)及其參與多藥耐藥機(jī)制的研究.pdf

1、本文研究目的： 1.觀察化療藥對(duì)胃癌親本敏感細(xì)胞和耐藥細(xì)胞的毒性； 2.探討MAD2蛋白在不同胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS、SGC7901和阿霉素耐藥細(xì)胞SGC7901/ADR中的表達(dá)及其意義： 3.探討MAD2選擇性剪切體MAD2β對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)的調(diào)控作用； 4.探討MAD2在正常胃粘膜組織和胃癌組織中的表達(dá)。 研究方法： 一、化療藥對(duì)胃癌親本敏感細(xì)胞和耐藥細(xì)胞的毒性1.通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞對(duì)化療

2、藥物的敏感性；2.利用劃痕法檢測(cè)化療藥對(duì)腫瘤細(xì)胞遷移能力的影響。 二、MAD2蛋白在不同胃癌細(xì)胞系和耐藥細(xì)胞中的表達(dá)及其意義。 1.細(xì)胞同步化：細(xì)胞同步化是指自然的或經(jīng)人為選擇或誘導(dǎo)選擇造成的細(xì)胞周期同步化，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用自然同步化法獲取化療藥物作用后不同時(shí)間段的細(xì)胞蛋白； 2.MAD2在胃癌耐藥細(xì)胞與親本細(xì)胞中的差異表達(dá)：應(yīng)用Westernblot技術(shù)檢測(cè)MAD2在胃癌細(xì)胞SGC7901及其耐藥細(xì)胞SGC7901/

3、ADR、AGS細(xì)胞中的表達(dá)差異； 3.MAD2在細(xì)胞內(nèi)的分布及表達(dá)強(qiáng)弱：用細(xì)胞免疫組織化學(xué)和細(xì)胞免疫熒光觀察MAD2在胃癌細(xì)胞中隨細(xì)胞周期改變的變化； 4.核型分析和有絲分裂關(guān)卡功能實(shí)驗(yàn)：用秋水仙素誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯于有絲分裂中期，檢測(cè)有絲分裂中期胃癌細(xì)胞染色體數(shù)目和形狀異常程度，以反映細(xì)胞有絲分裂關(guān)卡功能。 三、MAD2β對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)的調(diào)控作用。 1.生長(zhǎng)曲線繪制：把MTT法檢測(cè)結(jié)果繪制成穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的MA

4、D2β高表達(dá)及低表達(dá)細(xì)胞系及其對(duì)照細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線； 2.集落形成實(shí)驗(yàn)：用平板集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MAD2β對(duì)單細(xì)胞增殖能力的影響； 3.細(xì)胞遷移能力的檢測(cè)：用劃痕法檢測(cè)MAD2β是否對(duì)腫瘤細(xì)胞遷移能力有影響。 四、MAD2在臨床胃組織標(biāo)本中的表達(dá)。采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)MAD2在正常胃粘膜組織和胃癌組織中的表達(dá)，以了解MAD2與胃癌的進(jìn)展。 研究結(jié)果： 一、化療藥對(duì)胃癌親本敏感細(xì)胞和耐藥細(xì)胞的毒性與S

5、GC7901/ADR細(xì)胞相比，SGC7901細(xì)胞對(duì)化療藥敏感，化療藥作用二者之后SGC7901細(xì)胞大多數(shù)死亡；而SGC7901/ADR細(xì)胞對(duì)化療藥耐受，相當(dāng)數(shù)量細(xì)胞爬越痕跡線繼續(xù)生長(zhǎng)繁殖。 二、MAD2在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)和意義。 1.MAD2在胃癌親本敏感細(xì)胞和耐藥細(xì)胞中的表達(dá)Westemblot分析發(fā)現(xiàn)MAD2在6株胃癌細(xì)胞系中均有表達(dá)，而在耐藥細(xì)胞中的表達(dá)較胃癌親本細(xì)胞低；在胃癌細(xì)胞SGC7901/ADR中，還檢測(cè)出

6、0.53Kb的剪切體；不同種類胃癌細(xì)胞對(duì)各種化療藥的敏感性各有差異，在化療藥物作用下親本敏感細(xì)胞SGC7901、AGS中MAD2蛋白表達(dá)量明顯減少，而SGC7901/ADR中MAD2蛋白表達(dá)量變化不明顯，且與藥物的作用劑量有關(guān)；MAD2蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)有一定時(shí)間性。 2.MAD2在細(xì)胞內(nèi)的分布及表達(dá)強(qiáng)弱MAD2分布以膜核為主，胞漿也有；在間期和有絲分裂前期表達(dá)較高，進(jìn)入中期后表達(dá)逐漸降低，直至消失。 3.核型分析和有絲

7、分裂關(guān)卡功能實(shí)驗(yàn)以永生化胃粘膜上皮細(xì)胞GES為正常對(duì)照胃粘膜細(xì)胞模型，GES細(xì)胞核型較穩(wěn)定；惡性細(xì)胞核型分析，染色體畸變、數(shù)目不穩(wěn)定；處于有絲分裂中期的惡性細(xì)胞的累積數(shù)目明顯低于對(duì)照細(xì)胞，說(shuō)明惡性細(xì)胞的有絲分裂關(guān)卡功能下降。 三、MAD2β對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)的調(diào)控。 1.MAD2β抑制胃癌細(xì)胞的增殖：MAD2β表達(dá)增加后，細(xì)胞增殖減慢，細(xì)胞數(shù)明顯減少；siRNA下調(diào)MAD2β表達(dá)后，細(xì)胞生長(zhǎng)增快。 2.MAD2β抑制

8、胃癌細(xì)胞的集落形成能力：MAD2β表達(dá)上調(diào)降低SGC7901細(xì)胞在普通平板上的集落形成能力；而MAD2β表達(dá)下調(diào)使SGC7901/ADR細(xì)胞的集落形成能力明顯增強(qiáng)。 3.MAD2β對(duì)胃癌細(xì)胞遷移能力的影響：上調(diào)MAD2β的表達(dá)可以減弱SGC7901細(xì)胞的遷移能力。 四、MAD2在臨床胃組織標(biāo)本中的表達(dá)。MAD2在胃癌組織中的表達(dá)高于正常胃粘膜組織，但低于胃不典型增生組織。MAD2的表達(dá)與胃癌組織的分化程度和人群的地區(qū)分布

9、無(wú)明顯差異。 研究結(jié)論： 1.胃癌細(xì)胞多藥耐藥性形成過(guò)程中MAD2的表達(dá)和亞細(xì)胞定位都發(fā)生了改變，提示MAD2可能參與了胃癌多藥耐藥的發(fā)生。 2.MAD2在胃癌細(xì)胞耐藥性形成過(guò)程中的變化可能和細(xì)胞核內(nèi)化療藥物的濃度、毒性及作用時(shí)間均有關(guān)。 3.MAD2β可以抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，減弱單細(xì)胞的集落形成能力和細(xì)胞遷移能力，提示MAD2β與腫瘤的惡性表型相關(guān)。 4.MAD2在胃癌組織中表達(dá)與正常組織中的表