羊梨形蟲核糖體RNA內轉錄間隔區(qū)序列的測定及反向線狀印跡技術的建立.pdf

1、羊梨形蟲病(舊稱羊焦蟲病)是由頂復門、梨形蟲綱、梨形蟲目中的巴貝斯科(Babesiidae)巴貝斯屬(Babesia)和泰勒科(Theileriidae)泰勒屬(Theileria)的多種原蟲寄生于羊的紅細胞或網狀內皮細胞內所引起的一類血液原蟲病的統(tǒng)稱，臨床以高熱、貧血、黃疸、血紅蛋白尿或體表淋巴結腫大為主要特征，嚴重對可引起動物死亡。本病在我國分布廣、危害嚴重，常常給疫區(qū)的養(yǎng)羊業(yè)造成巨大損失。 本研究利用實驗室液氮保存的羊梨形

2、蟲病病原，包括2種(6株)羊的巴貝斯蟲和2種(2株)羊的泰勒蟲，采用核糖體RNA的兩個內轉錄間隔區(qū)(ITS1和ITS2)基因組區(qū)域和5.8S rRNA基因序列分析方法，對我國的新疆喀什地區(qū)、河北承德以及甘肅省的臨潭、寧縣、天祝、麻當六個不同地區(qū)羊的巴貝斯蟲和甘肅省的渭源、寧夏的隆德兩個地區(qū)羊泰勒蟲進行分子分類學及分子診斷研究。其主要研究結果包括兩個方面： 1。利用實驗室保存的8株羊梨形蟲，提取基因組DNA，測得ITS1-5.8S

3、-ITS2、ITS1、5.8S和ITS2序列，分別構建系統(tǒng)發(fā)生樹，并進行同源性比較。結果顯示我國羊的梨形蟲可明顯分為巴貝斯蟲和泰勒蟲兩枝；其中，莫氏巴貝斯蟲株之間的同源性明顯高于新疆喀什株未定種巴貝斯蟲。巴貝斯蟲的ITSl和rrS2核苷酸區(qū)段變異較大，種間同源性分別在19.7％-99.4％，河北株、寧縣株、臨潭株、天祝株和麻當株的巴貝斯蟲都是由血蜱屬傳播的，在遺傳演化過程中的親緣關系較近，同源性比較高，在ITS1-5.85-ITS2、I

4、TS1和ITS2序列的系統(tǒng)發(fā)生樹上，共處一枝。新疆喀什株是由璃眼蜱屬傳播的，被其它的一些巴貝斯蟲隔開，獨立占有一枝，可以認為是一個獨立的種。5.8S rRNA較保守，種間同源性在87.1％-100％之間，系統(tǒng)發(fā)生樹上各種巴貝斯蟲的分布與ITS1-5.8S-ITS2、ITS1和ITS2系統(tǒng)發(fā)生樹基本一致。兩種泰勒蟲之間的同源性比較高，同已經測得的18S rRNA基因區(qū)段相似，其ITS1和ITS2區(qū)段種間變異較小，ITS1-5.8S-ITS

5、2、ITS1、5.8S和ITS2序列的同源性分別為96.8％、96.4％、100％和95.2％。該結果與18s rRNA基因序列分類方法基本符合。 2。在已經確定的18S rRNA基因V4高變區(qū)段的基礎上，利用反向線狀印跡雜交技術(RLB)高特異性和高敏感性的特點，設計了梨形蟲通用探針和屬種特異性探針，用RLB技術檢測以上8株羊梨形蟲。所有種特異性探針都僅僅和它們各自的靶序列發(fā)生反應，無論是在不同蟲種，還是不同種群之間都沒有交叉

6、反應，與綿羊/山羊基因組對照試驗沒有雜交信號。將兩種羊巴貝斯蟲(莫氏巴貝斯蟲和巴貝斯蟲未定種喀什株)和兩種羊泰勒蟲(呂氏泰勒蟲渭源株，尤氏泰勒蟲隆德株)基因組經分光光度計定量在100ng/ul，連續(xù)10倍稀釋10-1-10-12，用RLB方法檢測，結果顯示泰勒蟲較羊巴貝斯蟲的敏感性高，莫氏巴貝斯蟲、巴貝斯蟲未定種喀什株、呂氏泰勒蟲和尤氏巴貝斯蟲的敏感性分別是0.01pg、0.1ng、0.0001pg、0.1pg，呂氏泰勒蟲的敏感性明顯高