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文檔簡介
1、正常聽力對于我們交流和認知非常重要。聽力的缺陷深深的影響到社會生活的方方面面。耳蝸螺旋神經(jīng)元是聽覺通路的初級傳入神經(jīng)元,它將聲音信息轉(zhuǎn)變?yōu)樯窠?jīng)沖動并向聽覺中樞傳導。在哺乳動物,螺旋神經(jīng)元一旦損傷即不可再生或修復(fù)。目前,耳蝸移植干細胞替代受損或缺失的毛細胞和或螺旋神經(jīng)元治療由此引起的感音神經(jīng)性耳聾已成為耳科學研究方面的重點和熱點問題。
為了順利把細胞移植入耳蝸,研究者采用了各種不同的手術(shù)方法和路徑,盡可能把移植細胞送到距離損傷部
2、位較近的位置或者直接送到損傷部位。例如:通過圓窗、鼓階、半規(guī)管把細胞送到外淋巴液系統(tǒng);也有學者把細胞經(jīng)中階直接注入內(nèi)淋巴液系統(tǒng)或通過基底膜上鉆孔把細胞輸送到中階;還有人試圖通過聽神經(jīng)中樞端移植入干細胞。
外源性干細胞移植后的狀態(tài),不僅受移植細胞類型、分化狀態(tài)、種屬來源的影響,還受宿主組織器官狀態(tài)影響,研究表明,受損器官或組織更利于移植細胞的存活。因此,選擇合適的移植細胞類型和受體動物模型,對研究耳蝸移植干細胞存活、增殖、分化和
3、功能重建具有重要意義。同時,研究病理狀態(tài)下?lián)p傷微環(huán)境中有關(guān)細胞趨化、增殖、分化的分子表達變化,對于我們更好的了解細胞替代治療的機制和機理也很有幫助。
本實驗中,我們選擇具有嗜神經(jīng)元毒性的毒毛旋花子甙誘導耳蝸螺旋神經(jīng)元損傷模型,試圖建立單純的螺旋神經(jīng)元凋亡,為后續(xù)試驗打下基礎(chǔ);鑒于耳蝸來源于外胚層,我們通過同樣是感覺上皮細胞的嗅球組織來源干細胞作為種子細胞,為了提高其干細胞特性,我們使用胚胎14.5天小鼠嗅球提取、分離干細胞;為
4、了更好的觀察移植細胞,我們選擇C57BL/6-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠作為細胞種屬來源;實驗中,我們探索了各種手術(shù)徑路,我們驚奇的發(fā)現(xiàn),移植到耳蝸外側(cè)壁的細胞具有向螺旋神經(jīng)節(jié)遷移的趨勢,于是我們設(shè)計了耳蝸外側(cè)壁移植細胞的實驗,通過觀察干細胞在耳蝸的分布來驗證該徑路是否可行,同時我們在移植位點注射示蹤劑,來驗證其可靠程度,我們設(shè)了假手術(shù)對照組,來驗證該手術(shù)方法對耳蝸功能的影響。最后,我們觀察了損傷微環(huán)境,CXCL12蛋白表達變化,探討CXCL12
5、/CXCR4信號通路是否參與耳蝸移植干細胞的遷移和在耳蝸分布的調(diào)節(jié)。
實驗一:SD大鼠耳蝸SGNs損傷模型
目的:獲得單純螺旋神經(jīng)元損傷動物模型,為后續(xù)實驗奠定基礎(chǔ)。
方法:選用16只成年大鼠,8只圓窗龕給藥,8只給生理鹽水作為對照,手術(shù)打開聽泡,暴露圓窗龕,10μl10mM毒毛旋花子甙生理鹽水溶液圓窗龕給藥,觀察給藥后ABR閾值變化,耳蝸切片觀察螺旋神經(jīng)元密度改變,毛細胞鋪片觀察毛細胞情況
結(jié)果
6、:HE染色顯示與正常耳蝸組織切片相比,給藥3天,螺旋神經(jīng)元顯著減少,給藥7天后,神經(jīng)元及其他細胞進一步減少,神經(jīng)節(jié)區(qū)域呈現(xiàn)一片“荒漠樣”改變;tubulin染色陽性細胞(神經(jīng)元細胞)在給藥3天后,細胞數(shù)量大幅減少,神經(jīng)纖維無明顯改變;7天后陽性細胞數(shù)進一步減少,基底膜鋪片結(jié)果顯示手術(shù)后7天,手術(shù)組及手術(shù)給藥組均未見明顯內(nèi)外毛細胞及纖毛的缺失,ABR閾值檢測顯示手術(shù)給藥物組ABR閾值顯著升高,單純手術(shù)組閾值升高不明顯。
結(jié)論:本
7、實驗成功建立了穩(wěn)定、可靠的單純螺旋神經(jīng)元損傷模型,該模型對內(nèi)耳其他組織和細胞無明顯傷害,為研究螺旋神經(jīng)元損傷和修復(fù)機制奠定了基礎(chǔ)。
實驗二:嗅球神經(jīng)干細胞培養(yǎng)
目的:獲得GFP+嗅球神經(jīng)干細胞,并對其干細胞特性及向神經(jīng)元分化能力進行了鑒定,為耳蝸細胞移植奠定了基礎(chǔ)。
方法:C57BL/6-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠2只,孕14.5天,取胎鼠8—-10只手術(shù)獲得繡球組織,分離后干細胞培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng),4-5天傳代一次,免
8、疫熒光方法鑒定其是否為神經(jīng)干細胞,體外向神經(jīng)元方向分化能力。
結(jié)果:取自胚胎第14.5天C57BL/6-GFP嗅球組織的干細胞在干細胞培養(yǎng)基中生長良好。在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)明亮的綠色熒光。細胞呈懸浮生長,并形成大小不等的神經(jīng)球,隨著培養(yǎng)時間增長,細胞球體積逐漸增大、折光性好,形態(tài)飽滿,說明細胞活性良好。細胞增殖能力強,每4-5天即需傳代,以保持適當細胞密度。細胞雖經(jīng)多次傳代,仍然保持了良好的干細胞特性,貼壁分化細胞較少。免疫細胞
9、化學結(jié)果顯示,培養(yǎng)的細胞表達GFP,并且大部分細胞表達神經(jīng)干細胞特異性標志物nestin。表明培養(yǎng)細胞大部分為神經(jīng)干細胞。培養(yǎng)嗅球干細胞經(jīng)誘導分化后,大部分表達早期神經(jīng)元標記物NSE,表明培養(yǎng)細胞具有很強的向神經(jīng)元分化的能力;同時,部分誘導分化的細胞表達成熟神經(jīng)元標記物NF200,提示培養(yǎng)細胞分化后轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓纳窠?jīng)元細胞。
結(jié)論:本實驗為耳蝸移植干細胞提供了可示蹤的,易向神經(jīng)元方向分化的,體外擴增容易的理想的種子細胞。
10、 實驗三:外側(cè)壁徑路耳蝸移植干細胞向螺旋神經(jīng)節(jié)遷移途徑
目的:探討耳蝸外側(cè)壁干細胞移植后向螺旋神經(jīng)節(jié)遷移能力,同時探討該手術(shù)對耳蝸形態(tài)和聽覺功能影響。
方法:選取成年SD雄性大鼠18只,實驗分為三組,一組8只,運用毒毛旋花子甙誘導SGNs損傷,2天后,耳蝸外側(cè)壁移植干細胞;一組正常大鼠兩只,分別經(jīng)耳蝸外側(cè)壁和鼓階注入熒光金顆粒,觀察細胞移植位點;一組正常大鼠8只,分為耳蝸外側(cè)壁手術(shù)和鼓階手術(shù)兩組,每組各4只8耳,分
11、別觀察耳蝸外側(cè)壁和鼓階模擬移植手術(shù)對正常耳蝸形態(tài)和聽覺功能的影響。
結(jié)果:移植1周后發(fā)現(xiàn)所有移植干細胞組耳蝸均有干細胞存活。移植的細胞主要分布在螺旋韌帶、基底膜、骨螺旋板和螺旋神經(jīng)節(jié)區(qū)域,其他在鼓階、前庭階和中階也有少量分布。在一個耳蝸中,我們發(fā)現(xiàn)GFP+細胞只有少數(shù)停留在螺旋韌帶,大部分細胞已經(jīng)遷移到螺旋神經(jīng)節(jié)區(qū)域,還有部分細胞位于螺旋韌帶和螺旋神經(jīng)節(jié)之間的基底膜及骨螺旋板。細胞分布提示我們基底膜具有潛在間隙允許移植干細胞從
12、螺旋韌帶向螺旋神經(jīng)節(jié)遷移。檢測到達神經(jīng)節(jié)區(qū)域移植細胞的分化情況,我們發(fā)現(xiàn)大部分移植細胞不表達Nestin,表明移植干細胞到達螺旋神經(jīng)節(jié)區(qū)域后,大部分已經(jīng)分化,失去干細胞特性;同時發(fā)現(xiàn)大部分GFP+細胞表達同時表達Tubulin,提示移植細胞到達螺旋神經(jīng)節(jié)區(qū)域后,大部分已經(jīng)分化為神經(jīng)元樣細胞。熒光金顆粒的分布差異表明我們采用的移植部位是準確的。我們在正常耳蝸模擬了手術(shù)操作;同時用鼓階作為對照。我們發(fā)現(xiàn)兩種手術(shù)對耳蝸螺旋神經(jīng)元細胞沒有明顯影
13、響,耳蝸基底膜鋪片發(fā)現(xiàn)毛細胞基本沒有缺失,對手術(shù)前后耳蝸ABR閾值檢測發(fā)現(xiàn),耳蝸外側(cè)壁移植干細胞的方法對耳蝸功能影響有限。
結(jié)論:我們的實驗發(fā)現(xiàn),耳蝸外側(cè)壁移植干細胞是一個新的耳蝸移植細胞方法,該方法對正常耳蝸功能影響有限,移植的細胞可以遷移到螺旋神經(jīng)節(jié)區(qū)域。
實驗四:耳蝸移植干細胞遷移受CXCL12/CXCR4信號通道調(diào)控
目的:探討損傷微環(huán)境后CXCL12表達變化,移植干細胞在耳蝸遷移及分布與CXCL1
14、2之間關(guān)系。
方法:取體外培養(yǎng)小鼠嗅球來源干細胞(待移植細胞)檢測其CXCL12/CXCR4表達情況,取正常耳蝸、螺旋神經(jīng)元損傷耳蝸、螺旋神經(jīng)元損傷后2天后移植干細胞耳蝸組織切片,檢測CXCL12表達變化與干細胞遷移及分布關(guān)系。
結(jié)果:免疫熒光染色結(jié)果表明,體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞表達CXCR4;同時具有分泌CXCL12能力;CXCL12在正常耳蝸即有表達,而在毒毛旋花子甙誘導螺旋神經(jīng)元損傷3天時,在變性、缺失神經(jīng)元細胞
15、周圍、蝸軸聽神經(jīng)中樞端和骨螺旋板聽神經(jīng)外周端,CXCL12表達明顯上調(diào),損傷7天時,螺旋神經(jīng)節(jié)區(qū)域表達CXCL12明顯下降,這一現(xiàn)象同時出現(xiàn)在聽神經(jīng)的中樞端和外周端。免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn),移植到前庭階的神經(jīng)干細胞在耳蝸內(nèi)有部分細胞繼續(xù)表達CXCR4,在聚集的移植細胞團中,CXCL12呈明顯的高表達;移植干細胞耳蝸發(fā)現(xiàn),CXCL12在損傷部位表達濃度梯度分布,與干細胞在螺旋韌帶、基底膜、骨螺旋板和螺旋神經(jīng)節(jié)分布相吻合。
結(jié)論:本實驗
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