大鼠耳蝸螺旋神經(jīng)元損傷后耳蝸外側(cè)壁移植干細胞遷移途徑及相關(guān)分子研究.pdf

1、正常聽力對于我們交流和認知非常重要。聽力的缺陷深深的影響到社會生活的方方面面。耳蝸螺旋神經(jīng)元是聽覺通路的初級傳入神經(jīng)元，它將聲音信息轉(zhuǎn)變?yōu)樯窠?jīng)沖動并向聽覺中樞傳導。在哺乳動物，螺旋神經(jīng)元一旦損傷即不可再生或修復(fù)。目前，耳蝸移植干細胞替代受損或缺失的毛細胞和或螺旋神經(jīng)元治療由此引起的感音神經(jīng)性耳聾已成為耳科學研究方面的重點和熱點問題。
　　為了順利把細胞移植入耳蝸，研究者采用了各種不同的手術(shù)方法和路徑，盡可能把移植細胞送到距離損傷部

2、位較近的位置或者直接送到損傷部位。例如：通過圓窗、鼓階、半規(guī)管把細胞送到外淋巴液系統(tǒng)；也有學者把細胞經(jīng)中階直接注入內(nèi)淋巴液系統(tǒng)或通過基底膜上鉆孔把細胞輸送到中階；還有人試圖通過聽神經(jīng)中樞端移植入干細胞。
　　外源性干細胞移植后的狀態(tài)，不僅受移植細胞類型、分化狀態(tài)、種屬來源的影響，還受宿主組織器官狀態(tài)影響，研究表明，受損器官或組織更利于移植細胞的存活。因此，選擇合適的移植細胞類型和受體動物模型，對研究耳蝸移植干細胞存活、增殖、分化和

3、功能重建具有重要意義。同時，研究病理狀態(tài)下?lián)p傷微環(huán)境中有關(guān)細胞趨化、增殖、分化的分子表達變化，對于我們更好的了解細胞替代治療的機制和機理也很有幫助。
　　本實驗中，我們選擇具有嗜神經(jīng)元毒性的毒毛旋花子甙誘導耳蝸螺旋神經(jīng)元損傷模型，試圖建立單純的螺旋神經(jīng)元凋亡，為后續(xù)試驗打下基礎(chǔ)；鑒于耳蝸來源于外胚層，我們通過同樣是感覺上皮細胞的嗅球組織來源干細胞作為種子細胞，為了提高其干細胞特性，我們使用胚胎14.5天小鼠嗅球提取、分離干細胞；為

4、了更好的觀察移植細胞，我們選擇C57BL/6-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠作為細胞種屬來源；實驗中，我們探索了各種手術(shù)徑路，我們驚奇的發(fā)現(xiàn)，移植到耳蝸外側(cè)壁的細胞具有向螺旋神經(jīng)節(jié)遷移的趨勢，于是我們設(shè)計了耳蝸外側(cè)壁移植細胞的實驗，通過觀察干細胞在耳蝸的分布來驗證該徑路是否可行，同時我們在移植位點注射示蹤劑，來驗證其可靠程度，我們設(shè)了假手術(shù)對照組，來驗證該手術(shù)方法對耳蝸功能的影響。最后，我們觀察了損傷微環(huán)境，CXCL12蛋白表達變化，探討CXCL12

5、/CXCR4信號通路是否參與耳蝸移植干細胞的遷移和在耳蝸分布的調(diào)節(jié)。
　　實驗一：SD大鼠耳蝸SGNs損傷模型
　　目的：獲得單純螺旋神經(jīng)元損傷動物模型，為后續(xù)實驗奠定基礎(chǔ)。
　　方法：選用16只成年大鼠，8只圓窗龕給藥，8只給生理鹽水作為對照，手術(shù)打開聽泡，暴露圓窗龕，10μl10mM毒毛旋花子甙生理鹽水溶液圓窗龕給藥，觀察給藥后ABR閾值變化，耳蝸切片觀察螺旋神經(jīng)元密度改變，毛細胞鋪片觀察毛細胞情況
　　結(jié)果

6、：HE染色顯示與正常耳蝸組織切片相比，給藥3天，螺旋神經(jīng)元顯著減少，給藥7天后，神經(jīng)元及其他細胞進一步減少，神經(jīng)節(jié)區(qū)域呈現(xiàn)一片“荒漠樣”改變；tubulin染色陽性細胞（神經(jīng)元細胞）在給藥3天后，細胞數(shù)量大幅減少，神經(jīng)纖維無明顯改變；7天后陽性細胞數(shù)進一步減少，基底膜鋪片結(jié)果顯示手術(shù)后7天，手術(shù)組及手術(shù)給藥組均未見明顯內(nèi)外毛細胞及纖毛的缺失，ABR閾值檢測顯示手術(shù)給藥物組ABR閾值顯著升高，單純手術(shù)組閾值升高不明顯。
　　結(jié)論：本

7、實驗成功建立了穩(wěn)定、可靠的單純螺旋神經(jīng)元損傷模型，該模型對內(nèi)耳其他組織和細胞無明顯傷害，為研究螺旋神經(jīng)元損傷和修復(fù)機制奠定了基礎(chǔ)。
　　實驗二：嗅球神經(jīng)干細胞培養(yǎng)
　　目的：獲得GFP+嗅球神經(jīng)干細胞，并對其干細胞特性及向神經(jīng)元分化能力進行了鑒定，為耳蝸細胞移植奠定了基礎(chǔ)。
　　方法：C57BL/6-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠2只，孕14.5天，取胎鼠8—-10只手術(shù)獲得繡球組織，分離后干細胞培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)，4-5天傳代一次，免

8、疫熒光方法鑒定其是否為神經(jīng)干細胞，體外向神經(jīng)元方向分化能力。
　　結(jié)果：取自胚胎第14.5天C57BL/6-GFP嗅球組織的干細胞在干細胞培養(yǎng)基中生長良好。在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)明亮的綠色熒光。細胞呈懸浮生長，并形成大小不等的神經(jīng)球，隨著培養(yǎng)時間增長，細胞球體積逐漸增大、折光性好，形態(tài)飽滿，說明細胞活性良好。細胞增殖能力強，每4-5天即需傳代，以保持適當細胞密度。細胞雖經(jīng)多次傳代，仍然保持了良好的干細胞特性，貼壁分化細胞較少。免疫細胞

9、化學結(jié)果顯示，培養(yǎng)的細胞表達GFP,并且大部分細胞表達神經(jīng)干細胞特異性標志物nestin。表明培養(yǎng)細胞大部分為神經(jīng)干細胞。培養(yǎng)嗅球干細胞經(jīng)誘導分化后，大部分表達早期神經(jīng)元標記物NSE,表明培養(yǎng)細胞具有很強的向神經(jīng)元分化的能力；同時，部分誘導分化的細胞表達成熟神經(jīng)元標記物NF200,提示培養(yǎng)細胞分化后轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓纳窠?jīng)元細胞。
　　結(jié)論：本實驗為耳蝸移植干細胞提供了可示蹤的，易向神經(jīng)元方向分化的，體外擴增容易的理想的種子細胞。

10、　　實驗三：外側(cè)壁徑路耳蝸移植干細胞向螺旋神經(jīng)節(jié)遷移途徑
　　目的：探討耳蝸外側(cè)壁干細胞移植后向螺旋神經(jīng)節(jié)遷移能力，同時探討該手術(shù)對耳蝸形態(tài)和聽覺功能影響。
　　方法：選取成年SD雄性大鼠18只，實驗分為三組，一組8只，運用毒毛旋花子甙誘導SGNs損傷，2天后，耳蝸外側(cè)壁移植干細胞；一組正常大鼠兩只，分別經(jīng)耳蝸外側(cè)壁和鼓階注入熒光金顆粒，觀察細胞移植位點；一組正常大鼠8只，分為耳蝸外側(cè)壁手術(shù)和鼓階手術(shù)兩組，每組各4只8耳，分

11、別觀察耳蝸外側(cè)壁和鼓階模擬移植手術(shù)對正常耳蝸形態(tài)和聽覺功能的影響。
　　結(jié)果：移植1周后發(fā)現(xiàn)所有移植干細胞組耳蝸均有干細胞存活。移植的細胞主要分布在螺旋韌帶、基底膜、骨螺旋板和螺旋神經(jīng)節(jié)區(qū)域，其他在鼓階、前庭階和中階也有少量分布。在一個耳蝸中，我們發(fā)現(xiàn)GFP+細胞只有少數(shù)停留在螺旋韌帶，大部分細胞已經(jīng)遷移到螺旋神經(jīng)節(jié)區(qū)域，還有部分細胞位于螺旋韌帶和螺旋神經(jīng)節(jié)之間的基底膜及骨螺旋板。細胞分布提示我們基底膜具有潛在間隙允許移植干細胞從

12、螺旋韌帶向螺旋神經(jīng)節(jié)遷移。檢測到達神經(jīng)節(jié)區(qū)域移植細胞的分化情況，我們發(fā)現(xiàn)大部分移植細胞不表達Nestin，表明移植干細胞到達螺旋神經(jīng)節(jié)區(qū)域后，大部分已經(jīng)分化，失去干細胞特性；同時發(fā)現(xiàn)大部分GFP+細胞表達同時表達Tubulin，提示移植細胞到達螺旋神經(jīng)節(jié)區(qū)域后，大部分已經(jīng)分化為神經(jīng)元樣細胞。熒光金顆粒的分布差異表明我們采用的移植部位是準確的。我們在正常耳蝸模擬了手術(shù)操作；同時用鼓階作為對照。我們發(fā)現(xiàn)兩種手術(shù)對耳蝸螺旋神經(jīng)元細胞沒有明顯影

13、響，耳蝸基底膜鋪片發(fā)現(xiàn)毛細胞基本沒有缺失，對手術(shù)前后耳蝸ABR閾值檢測發(fā)現(xiàn)，耳蝸外側(cè)壁移植干細胞的方法對耳蝸功能影響有限。
　　結(jié)論：我們的實驗發(fā)現(xiàn)，耳蝸外側(cè)壁移植干細胞是一個新的耳蝸移植細胞方法，該方法對正常耳蝸功能影響有限，移植的細胞可以遷移到螺旋神經(jīng)節(jié)區(qū)域。
　　實驗四：耳蝸移植干細胞遷移受CXCL12/CXCR4信號通道調(diào)控
　　目的：探討損傷微環(huán)境后CXCL12表達變化，移植干細胞在耳蝸遷移及分布與CXCL1

14、2之間關(guān)系。
　　方法：取體外培養(yǎng)小鼠嗅球來源干細胞（待移植細胞）檢測其CXCL12/CXCR4表達情況，取正常耳蝸、螺旋神經(jīng)元損傷耳蝸、螺旋神經(jīng)元損傷后2天后移植干細胞耳蝸組織切片，檢測CXCL12表達變化與干細胞遷移及分布關(guān)系。
　　結(jié)果：免疫熒光染色結(jié)果表明，體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞表達CXCR4；同時具有分泌CXCL12能力；CXCL12在正常耳蝸即有表達，而在毒毛旋花子甙誘導螺旋神經(jīng)元損傷3天時，在變性、缺失神經(jīng)元細胞

15、周圍、蝸軸聽神經(jīng)中樞端和骨螺旋板聽神經(jīng)外周端，CXCL12表達明顯上調(diào)，損傷7天時，螺旋神經(jīng)節(jié)區(qū)域表達CXCL12明顯下降，這一現(xiàn)象同時出現(xiàn)在聽神經(jīng)的中樞端和外周端。免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)，移植到前庭階的神經(jīng)干細胞在耳蝸內(nèi)有部分細胞繼續(xù)表達CXCR4，在聚集的移植細胞團中，CXCL12呈明顯的高表達；移植干細胞耳蝸發(fā)現(xiàn)，CXCL12在損傷部位表達濃度梯度分布，與干細胞在螺旋韌帶、基底膜、骨螺旋板和螺旋神經(jīng)節(jié)分布相吻合。
　　結(jié)論：本實驗