不同濃度胎牛血清對(duì)體外培養(yǎng)耳蝸螺旋神經(jīng)元的影響.pdf

1、第一部分不同濃度胎牛血清對(duì)螺旋神經(jīng)元體外培養(yǎng)的影響
　　 [目的]研究不同濃度胎牛血清對(duì)體外分離培養(yǎng)螺旋神經(jīng)元(SGNs)的相對(duì)存活率及突起生長長度的影響,尋找螺旋神經(jīng)元更適合的培養(yǎng)環(huán)境。
　　 [方法]選用出生1-3天的新生Sprague-Dawley大鼠30只,取蝸軸螺旋管,用0.125％胰蛋白酶進(jìn)行消化分離,制成單細(xì)胞懸液,分為6組,分別采用含不同體積濃度胎牛血清(0％,0.5％,1％,2％,5％,10％)的DME

2、M/F12(添加B27、N2)培養(yǎng)液進(jìn)行的培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況,在培養(yǎng)第3天及第5天固定細(xì)胞,用抗βⅢTublin單克隆抗體進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光染色鑒定SGNs,抗GFAP單克隆抗體鑒定雪旺細(xì)胞,DAPI復(fù)染確認(rèn)細(xì)胞核。在熒光顯微鏡下觀察、拍照,以無血清培養(yǎng)組作為對(duì)照組,計(jì)算SGNs相對(duì)存活率及測量突起生長長度。
　　 [結(jié)果]各個(gè)血清濃度組的螺旋神經(jīng)元在培養(yǎng)10天后仍能存活;在培養(yǎng)7天時(shí)不同神經(jīng)元突起之間形成聯(lián)系

3、,難以區(qū)分其末端。在培養(yǎng)3天及5天時(shí),SGNs的相對(duì)存活率隨著血清濃度增加而升高,呈劑量依賴關(guān)系。在較低血清濃度組(0.5％,1％,2％),突起再生長度較對(duì)照組長,但在5％及10％FBS組別中,再生突起明顯短于對(duì)照組,并出現(xiàn)突起分支增多的現(xiàn)象。
　　 [結(jié)論]螺旋神經(jīng)元的原代分離培養(yǎng)中,在培養(yǎng)3天及5天時(shí),胎牛血清能促進(jìn)SGNs的存活,但過高濃度的血清減少了神經(jīng)突起再生的平均長度,促進(jìn)突起分支生長,在無血清或低血清濃度的培養(yǎng)環(huán)境

4、中能獲得較長突起。
　　 第二部分抑制非神經(jīng)元細(xì)胞后胎牛血清
　　 對(duì)螺旋神經(jīng)元體外培養(yǎng)的影響
　　 [目的]觀察低工作濃度的阿糖胞苷抑制非神經(jīng)元細(xì)胞后,不同胎牛血清濃度對(duì)螺旋神經(jīng)元生長存活率及突起長度的影響。
　　 [方法]選用出生1-3天的新生Sprague-Dawley大鼠30只,取蝸軸螺旋管,用0.125％胰蛋白酶進(jìn)行消化分離,制成單細(xì)胞懸液,用含10％FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液在37℃、5％

5、CO2環(huán)境中進(jìn)行24小時(shí)的培養(yǎng)刺激細(xì)胞有絲分裂,去除培養(yǎng)液,在6個(gè)不同血清體積濃度(096,0.5％,1％,2％,5％,10％)的培養(yǎng)液中添加最終工作濃度為5μmol/L的阿糖胞苷(Cytarabine,Ara-C),培養(yǎng)48小時(shí)。漂洗去Ara-C后再繼續(xù)培養(yǎng);同時(shí)設(shè)立平行的不添加阿糖胞苷的各血清濃度對(duì)照組。倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況。在總共培養(yǎng)3天及5天時(shí)固定細(xì)胞,用βⅢTublin單克隆抗體進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光染色,鑒定SGNs;

6、抗GFAP單克隆抗體鑒定雪旺細(xì)胞;DAPI復(fù)染確認(rèn)細(xì)胞核。在熒光顯微鏡下觀察、拍照,以平行的無血清培養(yǎng)組作為對(duì)照組,計(jì)算SGNs相對(duì)存活率,測量突起再生長度;計(jì)算所有存活細(xì)胞相對(duì)密度。
　　 [結(jié)果]5μmol/L的Ara-C能明顯抑制細(xì)胞的增殖,大量成纖維細(xì)胞被去除。各組SGNs在這一作用環(huán)境中存活,神經(jīng)突起有再生。相對(duì)于Ara-C未作用組,單位視野存活細(xì)胞數(shù)明顯減少;在培養(yǎng)3天時(shí),隨著血清濃度增加,SGNs的相對(duì)存活率增加;