循環(huán)腫瘤細(xì)胞新型檢測方法的建立及其在臨床樣本中的應(yīng)用.pdf

1、第一部分、循環(huán)腫瘤細(xì)胞新型檢測方法的建立及其在臨床樣本中的驗證
　　循環(huán)腫瘤細(xì)胞在腫瘤早期診斷、個體化治療/療效評估及腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制研究等方面具有重要價值。然而由于其在人體循環(huán)系統(tǒng)中所占比例極低，循環(huán)腫瘤細(xì)胞的分離和鑒定成為臨床應(yīng)用的難點(diǎn)。oHSV1-hTERT-GFP是一種經(jīng)過基因改造的人單純皰疹病毒。我們將該病毒的復(fù)制關(guān)鍵基因ICP4的野生型啟動子替換為人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶的啟動子，并在ICP4下游連接GFP表達(dá)盒，以使該病毒在感染

2、細(xì)胞后，能在端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄環(huán)境的作用下激活下游綠色熒光蛋白的表達(dá)基因，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對腫瘤細(xì)胞的示蹤作用。本研究旨在利用該病毒捕獲循環(huán)腫瘤細(xì)胞，從而建立一種簡便、重復(fù)性好、靈敏度高的檢測方法，并進(jìn)一步對該檢測方法的可靠性及臨床應(yīng)用價值進(jìn)行探討。
　　在本研究中，我們首先對該方法是否能捕獲循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行驗證，包括:利用Western blot技術(shù)檢測腫瘤細(xì)胞系、腫瘤組織及正常細(xì)胞中端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶表達(dá)情況;該方法體外模擬回收率的測定;

3、熒光顯微鏡觀察病毒oHSV1--hTERT-GFP感染腫瘤細(xì)胞后GFP的時序表達(dá)情況;激光共聚焦技術(shù)驗證該方法捕獲腫瘤細(xì)胞的可靠性。結(jié)果顯示，腫瘤細(xì)胞系及組織均不同程度表達(dá)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶。該方法體外模擬回收率可達(dá)85％以上:外周血中加入SMMC7721細(xì)胞10，50，100(個)的檢出數(shù)分別為6.8±2.04，42.8±4.04，87.8±7.03，總體檢出率為90.1％，外周血中加入Huh7細(xì)胞10，50，100（個）的檢出數(shù)分別為6

4、.9±1.90，42.9±3.88，87.9±7.63，總體檢出率為90.02％。線性回歸分析顯示該方法捕獲的細(xì)胞數(shù)與實(shí)際腫瘤細(xì)胞數(shù)呈明顯相關(guān)性，r2＞0.95。此外不同腫瘤細(xì)胞系轉(zhuǎn)染病毒24小時后均可穩(wěn)定表達(dá)GFP蛋白，Confocal實(shí)驗確實(shí)肺癌患者循環(huán)血中表達(dá)GFP蛋白的細(xì)胞為腫瘤細(xì)胞。以上結(jié)果說明該方法能夠捕獲循環(huán)血中的腫瘤細(xì)胞。
　　隨后我們針對該方法的臨床檢驗效能進(jìn)行評估:收集了肺癌外周血標(biāo)本101例、肝癌患者外周血標(biāo)

5、本36例，將標(biāo)本裂解去除紅細(xì)胞后，按照MOI=1比例轉(zhuǎn)染重組病毒oHSV1--hTERT-GFP DNA，37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)24h，收集細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測CD45-/GFP+細(xì)胞并計數(shù)。臨床標(biāo)本檢測結(jié)果顯示100例正常人群中，真陰性率為97％（檢出細(xì)胞數(shù)＜3個/4mL血），101例肺癌及36例肝癌中，真陽性率分別為79.2％、91.6％。病理學(xué)診斷為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌及肝癌患者中，CTCs的陽性率均大于80％（肺腺癌81.3％

6、，肺鱗癌85.7％，肝癌95.7％），病理學(xué)診斷發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的病例中，CTCs檢測的陽性率為100％。提示該方法具有良好的檢測靈敏度及特異性。
　　最后，我們在40例肺腺癌標(biāo)本中比較了CellSearch方法和oHSV1--hTERT-GFP方法。結(jié)果顯示，40例標(biāo)本中oHSV1--hTERT-GFP法檢測的陽性率(70％)高于CellSearch(40％)，其中oHSV1--hTERT-GFP法檢測為陰性的病例在CellSear

7、ch中檢測結(jié)果仍為陰性。
　　綜上所述，本研究建立了一種新型循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測方法，并對該方法的可靠性及臨床應(yīng)用價值進(jìn)行了評估。該方法能夠特異性示蹤循環(huán)腫瘤細(xì)胞，具有潛在臨床應(yīng)用價值。
　　第二部分、oHSV1-hTERT-GFP法檢測CTCs在腦膠質(zhì)瘤中的臨床應(yīng)用
　　腦膠質(zhì)瘤是神經(jīng)系統(tǒng)最常見的腫瘤，占所有中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的40％-60％。具有高復(fù)發(fā)率、高死亡率及低治愈率的特點(diǎn)。膠質(zhì)瘤生長迅速，具有很強(qiáng)的侵襲性。膠質(zhì)瘤

8、復(fù)發(fā)形式多樣，但膠質(zhì)瘤的復(fù)發(fā)具有原位復(fù)發(fā)和很少顱外轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)。本研究以初治腦膠質(zhì)瘤患者外周血標(biāo)本為研究對象，檢測其循環(huán)腫瘤細(xì)胞，結(jié)合手術(shù)情況尋找膠質(zhì)瘤是否發(fā)生顱外轉(zhuǎn)移的事實(shí)證據(jù)。
　　在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)初治腦膠質(zhì)瘤患者在手術(shù)前即可檢測到循環(huán)腫瘤細(xì)胞，術(shù)前CTCs數(shù)目平均值為5±1個/4mL血，范圍為0-20個/4mL血。說明血腦屏障并不能阻擋膠質(zhì)瘤腫瘤細(xì)胞向循環(huán)血中播散。手術(shù)后第2天檢測同一患者的外周血腫瘤細(xì)胞，平均值為2.4±

9、3.4/4mL血，范圍為0-15/4 mL血。高級別膠質(zhì)瘤(WHOⅢ級或Ⅳ級)患者術(shù)后CTCs數(shù)目的減少較術(shù)前有顯著性差異，p=0.0004。低級別膠質(zhì)瘤（WHOⅠ級或Ⅱ級）術(shù)后CTCs數(shù)目較術(shù)前呈減少趨勢。該結(jié)果提示手術(shù)對膠質(zhì)瘤有一定的治療效果，能夠有效減少患者腫瘤負(fù)荷，此外術(shù)后CTCs數(shù)量有助于評估手術(shù)療效。隨后，我們對比分析腦膠質(zhì)瘤患者及肺癌腦轉(zhuǎn)移患者外周血白細(xì)胞基因表達(dá)水平。結(jié)果顯示在腦膠質(zhì)瘤樣本中白細(xì)胞免疫相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)。<