豬骨骼肌miRNA轉(zhuǎn)錄組分析及miR-486功能的初步研究.pdf

1、MicroRNA是長度約為22nt的小分子RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達。miRNA參與肌肉組織生長發(fā)育相關的一系列生物過程，包括肌肉細胞的增殖、分化、肥大、肌纖維類型轉(zhuǎn)換及肌肉疾病的發(fā)生。相對于源自丹麥的長白豬，廣西巴馬小型豬具有體型矮小、生長速度慢、瘦肉率低、肉質(zhì)更好的特征。目前，比較小型豬與正常體型豬肌肉組織發(fā)育相關的miRNA研究報道較少。探索巴馬小型豬和長白豬骨骼肌miRNA的差異表達，對于解析品種間肌肉生長發(fā)育差異分子機

2、理具有重要的意義。本研究分別構(gòu)建巴馬小型豬和長白豬出生后1日齡和180日齡背最長肌組織小RNA文庫，利用高通量測序技術鑒定肌肉發(fā)育相關的miRNA，檢測miRNA的表達譜，并對差異表達miRNA的靶基因進行注釋和信號通路富集，分析目的miRNA的潛在功能。采用QRT-PCR對10個差異表達miRNA進行了驗證，并檢測它們的組織表達譜及在背最長肌中的發(fā)育性變化規(guī)律，分析它們在肌肉發(fā)育過程中的可能功能。豬miR-486的表達和功能研究還未見

3、報道，為了解析miR-486的表達差異，本研究利用RACE技術克隆miR-486宿主基因sANK1的cDNA全長序列，對miR-486與其宿主基因的表達進行相關性分析，并分析其啟動子的功能;為了解豬miR-486的生物學功能，本研究對miR-486進行了靶基因預測和功能分析，檢測巴馬小型豬和長白豬背最長肌中靶基因涉及的IGF-1-PI3K/AKT-mTOR信號通路相關基因的表達規(guī)律，在C2C12成肌細胞上驗證miR-486對肌肉發(fā)育的影

4、響和可能的機制。本研究獲得的主要結(jié)果總結(jié)如下:1.巴馬小型豬與長白豬背最長肌小RNA文庫測序。分別構(gòu)建1日齡和180日齡巴馬小型豬(NB和AB組)及長白豬(NL和AL組)背最長肌小RNA文庫，并進行高通量測序，結(jié)果顯示4個小RNA文庫分別獲得的高質(zhì)量序列讀數(shù)分別為11955887、11975536、11955924和11975035，其中絕大多數(shù)序列長度在22nt，與哺乳動物miRNA的大小一致。去除冗余序列后4個文庫獲得長度為18nt

5、-30nt的clean reads讀數(shù)分別為11925255、11934400、11934796和11931683，對應的種類數(shù)分別為125347、121867、152944和136903。四個文庫中有大約85％的total序列與豬基因組匹配，50％以上的unique序列未與豬基因組匹配。NB與AB、NL與AL、NB與NL和AB與AL文庫間共有序列種類分別為30588、31861、39840和33533。分類注釋顯示，NB、AB、NL和

6、AL文庫中與已知的豬miRNA序列相匹配的序列數(shù)分別為85.52％、87.05％、81.94％和87.13％，未被注釋的序列數(shù)分別占序列總數(shù)的13.11％、11.79％、16.08％和11.76％。2.巴馬小型豬與長白豬背最長肌小RNA表達譜及差異分析。應用生物信息學技術分析小RNA表達譜，從四個文庫中共鑒定獲得292種已知的豬miRNA，利用Mireap軟件預測獲得86個候選miRNA，并采用RT-PCR成功驗證了其中的9個候選miR

7、NA。miRNA差異表達分析顯示:180日齡巴馬小型豬與1日齡巴馬小型豬相比，有151個差異表達的miRNA，其中18個顯著上調(diào)，133個顯著下調(diào);180日齡長白豬與1日齡長白豬相比，有161個差異表達的miRNA，其中21個顯著上調(diào)，140個顯著下調(diào)。1日齡巴馬小型豬與1日齡長白豬相比，有29個差異表達的miRNA，其中20個顯著上調(diào)，9個顯著下調(diào);180日齡巴馬小型豬與180日齡長白豬相比，有30個差異表達的miRNA，其中顯著上調(diào)

8、26個，顯著下調(diào)4個。為了驗證小RNA測序結(jié)果，克隆了豬10個miRNA的成熟體序列，并進行QRT-PCR檢驗，證實了小RNA文庫測序的結(jié)果可靠。3.差異表達miRNA的功能分析。差異表達小RNA的GO注釋分析結(jié)果顯示，NB與NL樣品間差異miRNA靶基因在細胞成分中顯著富集;AB與AL樣品間差異miRNA靶基因在生物學過程和分子功能中顯著富集。KEGG通路分析結(jié)果顯示巴馬小型豬與長白豬在1日齡中差異表達miRNA靶基因顯著富集到12個

9、通路，包括Notch信號通路、擴張型心肌病和肥厚性心肌病等;巴馬小型豬與長白豬在180日齡中差異表達的miRNA靶基因顯著富集到14個通路，包括磷脂酰肌醇信號系統(tǒng)、乙醛酸和二羧酸代謝、賴氨酸降解、血管平滑肌收縮通路等。4.10個高豐度差異表達miRNA的組織表達譜和表達規(guī)律以及功能分析。利用QRT-PCR的方法，檢測了10個miRNA(miR-1，miR-133a-3p，miR-148,miR-206,miR-486,miR-378,m

10、iR-181a/b和miR-103/107)在180日齡巴馬小型豬和長白豬中的組織表達譜及它們在豬出生后5個不同發(fā)育時期(Day1、Day30、Day60、Day90和Day180)背最長肌的表達規(guī)律。結(jié)果顯示miR-103/107、miR-148、miR-181a/b在組織中廣泛表達，miR-1/133和miR-378在肌肉中特異性表達，miR-486在肌肉中高豐度表達，miR-206僅在骨骼肌中特異表達;同時，這些miRNA在背最長

11、肌中的表達呈現(xiàn)顯著的日齡和品種差異性。10個miRNAs(miR181a/b、miR-103/107、miR-206、miR-378、miR-486、miR-499-5p、miR-423-5p和miR-432-5p)功能分析結(jié)果顯示:預測的靶基因在肌肉發(fā)育相關通路、肌肉疾病相關通路、細胞生物學過程相關通路、代謝相關通路以及神經(jīng)發(fā)育相關通路5大方面顯著富集。這些結(jié)果提示miRNA在豬肌肉發(fā)育中發(fā)揮重要的作用，可能影響巴馬小型豬和長白豬之間

12、肌肉生長和肉質(zhì)性狀的差異。5.豬miR-486宿主基因ANK1在肌肉中新轉(zhuǎn)錄本的鑒定。本研究首次應用RACE技術驗證了豬ANK1在39號內(nèi)含子中存在新的選擇性外顯子1(exon39a)，形成了ANK1短轉(zhuǎn)錄本sANK1基因，提示miR-486可能選擇較近內(nèi)含子作為其啟動子。通過全長cDNA PCR策略，克隆和分析了轉(zhuǎn)錄本的特征，結(jié)果顯示豬sANK1基因編碼區(qū)存在3種ORF序列，可以形成3種可變剪接體（sANK1-1，sANK1-2和sA

13、NK1-3）。生物信息學分析結(jié)果表明豬sANK1的3種可變剪接體是功能比較活躍的蛋白，可能參與信號傳導和細胞生長調(diào)控等一系列生物過程。6.miR-486與宿主基因sANK1基因的表達相關性分析。豬miR-486與其宿主基因的表達關系研究結(jié)果顯示:豬miR-486在DNA和cDNA中均可通過PCR擴增獲得，且ANK1基因存在正常的外顯子剪切，表明miR-486的初始轉(zhuǎn)錄本與宿主基因ANK1基因的轉(zhuǎn)錄本共表達。半定量PCR結(jié)果顯示miR-4

14、86在肌肉組織中表達量最高，sANK1在心肌、背最長肌和股二頭肌中特異性表達，說明二者在肌肉發(fā)育中均具有重要作用。QRT-PCR結(jié)果顯示miR-486和宿主sANK1基因在豬出生后背最長肌生長發(fā)育過程中和C2C12細胞分化過程中的表達均呈相似的上升趨勢。表達相關性分析結(jié)果表明miR-486與sANK1基因在肌肉發(fā)育中的表達呈現(xiàn)正相關，其中，在巴馬小型豬背最長肌中相關系數(shù)為r2=0.773(P=0.125);在長白豬中相關系數(shù)為r2=0.

15、698(P=0.19);在C2C12成肌細胞分化過程相關系數(shù)為r2=0.999(P＜0.05)。這些結(jié)果進一步證實miR-486與sANK1基因在豬肌肉組織中共享同一個啟動子。7.miR-486/sANK1基因在巴馬小型豬和長白豬背最長肌中差異表達的機制。QRT-PCR結(jié)果顯示miR-486在1、60、90和180日齡巴馬小型豬中的表達量高于長白豬，sANK1基因在60、90、180日齡巴馬小型豬中的表達量高于長白豬。為了解析miR-4

16、86/sANK1基因在巴馬小型豬和長白豬中的表達差異，克隆豬miR-486/sANK1基因的啟動子，并分析啟動子區(qū)SNP和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。結(jié)果顯示啟動子區(qū)存在18個SNP位點，其中有14個SNP位點導致轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的改變。通過構(gòu)建巴馬小型豬和長白豬miR-486/sANK1啟動子表達載體pEGFP-BP1、pEGFP-BP2、pEGFP-LP1、pEGFP-LP2，并在不同細胞中驗證了啟動子的功能，結(jié)果顯示啟動子只在C2C12細胞

17、中具有較強的啟動功能，說明啟動子具有肌肉特異性;P1片段啟動子的活性顯著高于P2片段的活性(P＜0.01);BP1和BP2啟動子活性均分別極顯著高于LP1和LP2啟動子活性(P＜0.01)，表明巴馬小型豬sANK1啟動子活性高于長白豬。進一步分析結(jié)果顯示巴馬小型豬啟動子區(qū)-401位堿基由A突變成G產(chǎn)生了轉(zhuǎn)錄因子MyoD的結(jié)合位點，這可能導致巴馬小型豬與長白豬sANK1啟動子活性的差異，進而影響miR-486/sANK1基因的表達。8.I

18、GF-1-PI3K/AKT-mTOR信號通路相關基因在巴馬小型豬和長白豬背最長肌中的表達規(guī)律。本實驗克隆了豬p85α(PI3KR1)基因完整的CDS序列，結(jié)果顯示巴馬小型豬p85α基因CDS序列長2175bp，生物信息學分析發(fā)現(xiàn)它具有SH3和SH2結(jié)構(gòu)域及與信號傳導相關的RhoGAP結(jié)構(gòu)域，能夠與IRS1、PTEN、IRS2等蛋白互作。利用QRT-PCR檢測IGF-1-PI3K/AKT-mTOR信號通路各基因在巴馬小型豬和長白豬出生后5

19、個不同發(fā)育時期（Day1、Day30、Day60、Day90和Day180）背最長肌的表達情況，結(jié)果顯示PTEN、FoxO1和4EBP1基因在兩個品種各個日齡中的表達量均顯著高于其他基因(P＜0.05)，而且，IGF-1-PI3K/AKT-mTOR信號通路各基因在背最長肌中的表達呈現(xiàn)顯著的日齡和品種差異性，這種差異可能是影響巴馬小型豬和長白豬肌肉性狀差異的原因之一。9.miR-486在IGF-1-PI3K/AKT-mTOR信號通路中的作

20、用。本研究結(jié)果表明，在正常的生理條件下，miR-486與靶基因IGF-1、p85α、PTEN和FoxO1基因在豬出生后背最長肌的生長發(fā)育過程中的表達呈現(xiàn)負相關。C2C12細胞中分別過表達和抑制miR-486，利用QRT-PCR檢測細胞中IGF-1-PI3K/AKT-mTOR信號通路相關基因的表達。結(jié)果顯示:過表達miR-486抑制了PTEN和FoxO1基因的表達，同時INSR、IRS1、AKT1、PDK1、mTOR和4EBP1基因的mR