miR-181a對牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分化的影響.pdf

1、MicroRNA是一類是基因表達(dá)的重要調(diào)控因子，屬于非編碼的小RNA分子，具有調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和凋亡的機(jī)理功能。過去人們常常在轉(zhuǎn)錄水平上研究肌肉基因表達(dá)，最近發(fā)現(xiàn)miRNA可以作為轉(zhuǎn)錄后調(diào)控分子，在骨骼肌發(fā)育中具有一定的調(diào)控作用，讓人們對肌肉發(fā)育有著更深刻的理解。
　　本次研究轉(zhuǎn)錄后水平探討miRNA在牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分化過程中的表達(dá)調(diào)控機(jī)制。在用高通量深度測序(HiSeq deep sequencing)技術(shù)對牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞

2、分化過程中不同時間不同miRNA進(jìn)行測序時，發(fā)現(xiàn)miRNA-181a在牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分化過程中表達(dá)量明顯升高。我們推測該microRNA可能參與了對牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分化的調(diào)控作用。我們用實時熒光定量RT-PCR（qRT-PCR）技術(shù)對分化不同時期的miRNA-181a表達(dá)量進(jìn)行了測定，發(fā)現(xiàn)與高通量測序結(jié)果一致。所以本實驗就以miR-181a作為研究對象，探究miR-181a在牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的作用。
　　利用生物學(xué)信息學(xué)方法分析

3、miRNA-181a可能的靶基因，經(jīng)過分析發(fā)現(xiàn)HOX-A11可能是其中一個靶基因。
　　通過雙熒光素酶報告系統(tǒng)實驗、免疫熒光，模擬物和抑制劑、qRT-PCR、Western blot等技術(shù)，研究了miR-181a對HOX-A11以及有關(guān)分化相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄后水平的表達(dá)調(diào)控作用。通過實驗發(fā)現(xiàn)miRNA-181a可以靶向HOX-A11進(jìn)而對牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分化產(chǎn)生調(diào)控作用。HOX-A11是一種能夠抑制細(xì)胞的分化基因。miRNA-181a在

4、牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分化的影響，對增加經(jīng)濟(jì)價值具有重要的指導(dǎo)意義。
　　實驗結(jié)果如下:
　　在牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞中，用Real-time PCR檢測不同時間miR-181a表達(dá)量，隨著時間增長，miR-181a的表達(dá)量極顯著增加。
　　通過用免疫熒光的方法，檢測細(xì)胞的中的結(jié)蛋白進(jìn)而統(tǒng)計肌管數(shù)量，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-181a-M模擬物的肌管的數(shù)量比miR-181a-M-NC對照組顯著增加，轉(zhuǎn)染miR-181a-Ⅰ抑制劑的比miR-

5、181a-Ⅰ-NC對照組顯著降低，我們從形態(tài)學(xué)上更能直觀看到miR-181a對牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分化的促進(jìn)作用。
　　轉(zhuǎn)染miR-181a-M模擬物的牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞，有關(guān)肌肉分化蛋白質(zhì)如MyoD，MyoG和MYH3的表達(dá)量明顯增加，而轉(zhuǎn)染miR-181a-Ⅰ抑制劑的，表達(dá)量明顯降低，進(jìn)一步證實miR-181a能夠促進(jìn)細(xì)胞的分化。
　　在雙熒光素酶報告系統(tǒng)中，miRNA-181a能夠和HOX-A11基因的3'-UTR結(jié)合時，熒

6、光素酶活性明顯下降，miRNA-181a和突變的3'-UTR結(jié)合時，熒光素酶活性沒有下降，進(jìn)一步說明HOX-A11是miR-181a的靶基因。
　　用Western blot檢測不同時期靶基因HOX-A11蛋白表達(dá)量，隨著時間的增長，HOX-A11蛋白的表達(dá)逐漸降低。說明miR-181a的表達(dá)水平與HOX-A11基因蛋白表達(dá)水平呈反比關(guān)系，為常見的miRNA-靶基因互作關(guān)系。
　　在牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染miR-181a-