非病毒載體（CyD-DABs）在消化系統(tǒng)腫瘤“靶向治療”中的應用研究.pdf

1、聚丙基乙烯亞胺樹枝狀聚合物(Polypropylenime dendrimers，DABs)是一類陽離子聚合物，表面攜帶-NH2，富含陽離子，能有效結(jié)合DNA，并通過內(nèi)吞方式進入細胞進行表達。本研究以CyD為骨架，結(jié)合低分子量DABs，目的在于不增加細胞毒性的前提下提高載體的轉(zhuǎn)染效率，并進一步耦合腫瘤特異性配體——葉酸，在胃、腸、肝臟惡性腫瘤細胞中驗證配體化合物CyD-DAB-FA的細胞毒性及轉(zhuǎn)染效率，從中篩選出消化系統(tǒng)腫瘤靶向性的非病

2、毒載體，進一步應用于腫瘤的體內(nèi)及臨床治療。 研究分為三部份：第一部分：CyD-DABs載體化合物的合成與化學表征，檢測載體化合物的性質(zhì)和對DNA的包裹、濃聚能力；第二部分：CyD-DABs載體化合物的生物學表征，通過體外細胞毒性檢測及轉(zhuǎn)染實驗，從中篩選出高轉(zhuǎn)染效率、低毒性的載體化合物，應用于下一步實驗；第三部分：將第二部分篩選出的CyD-DABs載體化合物耦合配體葉酸，構(gòu)建CyD-DAB-FA配體化合物，進行化學表征，并通過體外

3、細胞毒性與轉(zhuǎn)染實驗檢測配體化合物的細胞毒性與轉(zhuǎn)染效率，評價其在體內(nèi)應用的價值。 第一部分：CyD-DABs載體化合物的合成與化學表征 目的：以CyD為骨架，結(jié)合DABs，優(yōu)化合成條件，通過化學方法表征產(chǎn)物的性質(zhì)，并通過凝膠電泳分析與電鏡觀察、粒徑、表面電荷測定等方法，檢測載體化合物對DNA的包裹、濃聚能力。 方法：以CDI為連接媒介，合成CyD-DABs，通過核磁共振(HNMR)、元素分析、傅立葉紅外光譜(FT-

4、IR)、熱重量分析(TGA)等方法測定化合物的理化性質(zhì)。將CyD-DABs與DNA結(jié)合后，通過凝膠電泳分析確定化合物對DNA的包裹與濃聚能力，掃描電鏡觀察確定結(jié)合后的微粒大小，并測定其粒徑與表面攜帶電荷量。 結(jié)果：共合成18種CyD-DABs載體化合物。1H NMR、FT-IR、TGA．檢測結(jié)果顯示CyD-DABs為耦聯(lián)產(chǎn)物，形成新的基團，但仍保留CyD與DAB各自的屬性。1HNMR顯示CyD-DABs中CyD及DAB的各自接入

5、量，并通過元素分析進一步驗證兩者接入比例。 結(jié)論：CyD-DABs載體化合物能有效結(jié)合DNA，結(jié)合后的復合物直徑在150～200nm之間，表面帶正電荷，能與細胞膜結(jié)合并被內(nèi)吞。 第二部分：CyD-DABs載體化合物的生物學表征 目的：通過體外細胞學實驗檢測載體化合物CyD-DABs的細胞毒性與基因轉(zhuǎn)染能力，優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，并從中篩選毒性低、轉(zhuǎn)染效率高的化合物，用于下一步實驗。 方法：將CyD-DABs按不同

6、濃度作用于COS7、HepG2、SGC7901、RKO細胞，24小時后，MTT法檢測細胞存活率，計算載體化合物的細胞毒性。并將CyD-DABs與熒光素酶表達質(zhì)粒pCAG-Luc結(jié)合后，分別應用于COS7、HepG2、SGC7901、RKO、SMMC7721細胞，轉(zhuǎn)染后繼續(xù)表達24～48小時，通過熒光素酶表達水平檢測及熒光顯微鏡觀察，測定其轉(zhuǎn)染效率，并從中篩選出毒性低、轉(zhuǎn)染效果佳的化合物。 結(jié)果：CyD-DABs載體化合物在各類細

7、胞中均具有良好的安全性，在轉(zhuǎn)染濃度范圍內(nèi)，細胞存活率均>90％，但CyD-DAB-16細胞毒性相對較大，濃度增加至25gg/ml時僅有一半細胞存活，在轉(zhuǎn)染實驗中發(fā)現(xiàn)細胞死亡較多，影響轉(zhuǎn)染效率。CyD-DAB-4及CyD-DAB-8毒性小，適合進一步轉(zhuǎn)染。其中α-CyD-DAB-8、β-CyD-DAB-8、γ-CyD-DAB-8在轉(zhuǎn)染過程中顯示良好的轉(zhuǎn)基因性能，在無血清轉(zhuǎn)染條件下，已接近或超過陽性對照PEI 25KD的轉(zhuǎn)染水平，而在有血清

8、轉(zhuǎn)染條件下，轉(zhuǎn)染效率有所降低，但仍顯著超過陽性對照組。 結(jié)論：α-CyD-DAB-8、β-CyD-DAB-8、r-CyD-DAB-8細胞毒性小，轉(zhuǎn)染效率高。在有血清條件下，轉(zhuǎn)染效率較陽性對照組高，表明載體化合物更適用于體內(nèi)研究，因此選擇這三種載體化合物進行下一步實驗。 第三部分：葉酸配體耦合的CyD-DAB-FA配體化合物的化學與生物學表征 目的：α-CyD-DAB-8、β-CyD-DAB-8、γ-CyD-DAB

9、-8耦合腫瘤特異性配體——葉酸(folatc，F(xiàn)A)，進行化學表征與生物學表征，評價耦合葉酸的配體化合物的毒性、轉(zhuǎn)染能力與靶向性。體外細胞學實驗進一步評價毒性與轉(zhuǎn)染性能。 方法：葉酸經(jīng)CDI活化后，分別與α-CyD-DAB-8、β-CyD-DAB-8、γ-CyD-DAB-8混合反應，形成配體化合物α-CyD-DAB-8-FA、β-CyD-DAB-8-FA、γ-CyD-DAB-8-FA。通過1HNMR、FT-IR表征化合物的理化性

10、質(zhì)。在葉酸受體陽性(FR+)的KB細胞系中，通過MTT試驗檢測配體化合物的細胞毒性。將耦合配體的載體化合物與pCMV-1uc質(zhì)粒結(jié)合后，作用于KB細胞，繼續(xù)增殖表達48小時，測定熒光素酶活性，并分別以α-CyD-DAB-8、β-CyD-DAB-8、γ-CyD-DAB-8與FA的混合物及PEI 25KD為陰性和陽性對照。模擬體內(nèi)環(huán)境進行有血清條件下轉(zhuǎn)染，檢測配體化合物在血清中的轉(zhuǎn)染效率。 結(jié)果：配體化合物α-CyD-DAB-8-F

11、A、β-CyD-DAB-8-FA、γ-CyD-DAB-8-FA在低濃度時有一定的促細胞增殖作用，而隨濃度增加，細胞毒性無明顯增加，在100μg/ml時細胞存活率仍為90％。在KB細胞中進行配體化合物的轉(zhuǎn)染實驗，結(jié)果提示無血清轉(zhuǎn)染條件下，β-CyD-DAB-8-FA的轉(zhuǎn)染效率超過陽性對照PEI25KD，而α-CyD-DAB-8-FA、β-CyD-DAB-g-FA、γ-CyD-DAB-S-FA的轉(zhuǎn)染效率較單純將α-CyD-DAB-8、β-C

12、yD-DAB-8、γ-CyD-DAB-8與FA混合明顯增高。在有血清轉(zhuǎn)染條件下，新化合物轉(zhuǎn)染性能較單純混合物增加更明顯，其中α-CyD-DAB-8-FA、β-CyD-DAB-8-FA的轉(zhuǎn)染效率顯著超過陽性對照PEI 25KD。 結(jié)論：耦合配體FA后的配體化合物，其轉(zhuǎn)染效率較未接入配體時明顯增加，并且在血清中顯示良好的轉(zhuǎn)染性能，其中α-CyD-DAB-8-FA、β-CyD-DAB-8-FA轉(zhuǎn)染效率高，可進一步用于體內(nèi)FR表達陽性的

13、腫瘤治療。 主要結(jié)論： 1、本研究合成了一系列CyD-DABs化合物，優(yōu)化了合成條件，通過化學方法表征了化合物的理化性質(zhì)。 2、體外細胞學實驗中優(yōu)化CyD-DAB載體化合物的轉(zhuǎn)染條件，并模擬體內(nèi)環(huán)境進行轉(zhuǎn)染，發(fā)現(xiàn)CyD-DAB-8有良好的轉(zhuǎn)基因能力，從中篩選出低毒性、高轉(zhuǎn)染效率的化合物α-CyD-DAB-8、β-CyD-DAB-8、γ-CyD-DAB-8。 3、本研究成功將CyD-DABs載體化合物與葉酸

14、以化學方法耦聯(lián)，最終獲得可溶性配體化合物α-CyD-DAB-8-FA、β-CyD-DAB-8-FA、γ-CyD-DAB-8-FA。 4、進一步通過體外細胞轉(zhuǎn)染，發(fā)現(xiàn)α-CyD-DAB-8-FA、β-CyD-DAB-8-FA、γ-CyD-DAB-8-FA在FA受體(FR)表達陽性的細胞中有較高的轉(zhuǎn)染效率，并且在有血清條件下其轉(zhuǎn)染性能不受影響。其中α-CyD-DAB-8-FA、β-CyD-DAB-8-FA在血清中轉(zhuǎn)染效率顯著高于傳統(tǒng)

15、非病毒載體PEI 25KD及α-CyD-D AB-8、β-CyD-DAB-8。 5、載體化合物CyD-DAB的細胞毒性有以下趨勢：γ-CyD-DAB-16>β-CyD-DAB-16>a-CyD-DAB-16>γ-CyD-DAB-8>p-CyD-DAB-8≥α-CyD-DAB-8≥γ-CyD-DAB-4≥β-CyD-DAB-4≥a-CyD-DAB-4?；衔锱c葉酸連接后，其細胞毒性減低，并在低濃度時有輕度促細胞生長作用，表明葉酸配