中國(guó)紅豆杉中調(diào)控Taxol合成的TcWRKY轉(zhuǎn)錄因子的克隆及分析.pdf

1、紫杉醇是從紅豆杉屬植物中提取的一類具有獨(dú)特抗癌功效的次級(jí)代謝產(chǎn)物，目前市場(chǎng)供需矛盾突出。植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇是解決這一矛盾的有效方法之一，而轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的明晰有助于提高其產(chǎn)業(yè)化水平。轉(zhuǎn)錄因子是植物次生代謝產(chǎn)物合成中最為重要的調(diào)節(jié)因子之一。WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族是植物特有的超基因家族，對(duì)植物的生長(zhǎng)、發(fā)育、防御、代謝等生理活動(dòng)具有重要作用。本文對(duì)中國(guó)紅豆杉轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中的TcWRKY基因進(jìn)行了篩選和克隆，并初步探究了TcWRKY轉(zhuǎn)錄因

2、子在紫杉醇合成過(guò)程中的功能和機(jī)理。本研究主要取得了以下結(jié)果：
　　（1）中國(guó)紅豆杉中TcWRKY轉(zhuǎn)錄因子的篩選與進(jìn)化分析。本課題從中國(guó)紅豆杉轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)[1]中共篩選到61個(gè)TcWRKY基因。對(duì)61個(gè)TcWRKY轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行進(jìn)化和聚類分析發(fā)現(xiàn)，屬于I類WRKY轉(zhuǎn)錄因子有16個(gè)，II類共44個(gè)，III類則只有1個(gè)。而44個(gè)II類TcWRKY轉(zhuǎn)錄因子又分屬于IIa（8個(gè)）、IIb（10個(gè)）、IIc（14個(gè)）、IId（5個(gè)）和IIe（7

3、個(gè)）5個(gè)亞類。
　　（2）TcWRKY轉(zhuǎn)錄因子響應(yīng)激素誘導(dǎo)的表達(dá)特征分析。根據(jù)聚類分析和序列比對(duì)結(jié)果，分別在各亞類中選取1個(gè)TcWRKY轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行進(jìn)一步探究：TcWRKY8（IIc類）、TcWRKY20（III類）、TcWRKY26（I類）、TcWRKY41（IIe類）、TcWRKY44（IId類）、TcWRKY47（IIa類）和TcWRKY52（IIb類）。對(duì)其進(jìn)行MJ和SA誘導(dǎo)后，發(fā)現(xiàn)TcWRKY44、TcWRKY47在MJ

4、和SA誘導(dǎo)后均有明顯上調(diào)；MJ對(duì)TcWRKY8、TcWRKY20、TcWRKY26、TcWRKY41都有顯著上調(diào)作用，而SA對(duì)以上4個(gè)基因均有明顯抑制；TcWRKY52對(duì)MJ沒(méi)有明顯響應(yīng)且受到SA的顯著抑制。
　　（3）TcWRKY基因超表達(dá)對(duì)紫杉醇合成相關(guān)基因的影響。選取顯著響應(yīng)于 MJ的TcWRKY8、TcWRKY20、TcWRKY26、TcWRKY44、TcWRKY47基因，分別在中國(guó)紅豆杉細(xì)胞中超表達(dá)后，研究了其對(duì)紫杉醇合

5、成相關(guān)酶基因DBAT和T5H，及紫杉醇合成調(diào)控因子基因TcERF12和TcERF15表達(dá)的影響。其中，TcWRKY44超表達(dá)明顯抑制了以上4個(gè)基因的表達(dá)；TcWRKY20、TcWRKY26超表達(dá)能在不同程度上提高以上4個(gè)基因的表達(dá)水平；而 TcWRKY8、TcWRKY47超表達(dá)提高了DBAT、T5H、TcERF15的表達(dá)，抑制了TcERF12的表達(dá)。
　?。?）TcWRKY47轉(zhuǎn)錄因子與 DBAT啟動(dòng)子作用方式的探究。由于TcWR

6、KY47能夠明顯響應(yīng)MJ和SA，且對(duì)紫杉醇合成相關(guān)酶具有一定的正向調(diào)控作用，本課題研究了TcWRKY47轉(zhuǎn)錄因子與DBAT啟動(dòng)子在中國(guó)紅豆杉細(xì)胞內(nèi)的作用方式。通過(guò)突變DBAT啟動(dòng)子上的W-box后發(fā)現(xiàn)，當(dāng)有WA-box的存在或只有WC-box存在時(shí)，TcWRKY47與DBAT啟動(dòng)子的結(jié)合較弱，當(dāng) WB-box存在且不存在WA-box時(shí)，TcWRKY47與DBAT啟動(dòng)子的結(jié)合作用有較明顯提高。以上結(jié)果說(shuō)明，TcWRKY47與DBAT啟動(dòng)子