三種豬源性細(xì)胞外基質(zhì)體內(nèi)降解規(guī)律的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景:
　　 復(fù)雜腹壁缺損的修復(fù)仍然是再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一個巨大難題，對這項(xiàng)難題的認(rèn)識是每一位外科醫(yī)生所面臨的共同問題，于是腹壁缺損的再造便成為學(xué)者們近些年來研究的熱點(diǎn)問題之一，臨床上眾多學(xué)科頻繁的交流合作以尋求腹壁缺損再造的最佳方法，例如:普通外科、整形外科以及創(chuàng)傷外科等，然而即使我們不懈的努力，組織缺損的部位也很難達(dá)到理想的修復(fù)效果，術(shù)后病人的生活質(zhì)量也遠(yuǎn)不如預(yù)想的好。為解決這一難題，人們一方面著眼于外科手術(shù)技巧的改良，另一方面

2、，為尋找最適合于腹壁修復(fù)的材料而進(jìn)行著探索。
　　 人們在探索的過程中逐漸認(rèn)識到，三維空間結(jié)構(gòu)對組織的重建起到非常重要的作用，這種特殊的空間結(jié)構(gòu)能夠在組織修復(fù)的過程中控制細(xì)胞的功能，又能夠促進(jìn)修復(fù)區(qū)形成新的組織。因?yàn)槿S空間結(jié)構(gòu)能夠?yàn)楦杉?xì)胞等提供原始傳代場所，使這些細(xì)胞能夠在恰當(dāng)?shù)牡胤骄奂?，并為這些細(xì)胞的粘附、遷移、增值和分化提供生物活性物質(zhì)，隨著材料植入病人體內(nèi)時間的延長，材料本身會逐步完成降解，被新生的組織結(jié)構(gòu)取代，從而完成

3、腹壁缺損的修復(fù)過程，因此，理想的腹壁修復(fù)材料應(yīng)該具有生物相容性、可降解性等優(yōu)點(diǎn)，還要能夠?yàn)楦杉?xì)胞提供生物活性肽等成份。以上種種特殊的使用條件，進(jìn)一步推動了生物補(bǔ)片在醫(yī)學(xué)界的發(fā)展和應(yīng)用，近些年來，人們找到一種具備上述所有特點(diǎn)的一種腹壁修復(fù)材料——細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)。
　　 細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)一直以來都被視為一種天然的、理想的生物支架材料。細(xì)胞外基質(zhì)的構(gòu)造是利用組織或器官自身的細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)的，因此，它能夠和周圍的微環(huán)境形成一種動態(tài)

4、平衡狀態(tài)。細(xì)胞外基質(zhì)獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)，能夠促使機(jī)體內(nèi)相鄰的細(xì)胞相互作用，此外，它還能夠?yàn)檠?、神?jīng)和淋巴管等提供一個支持性的介質(zhì)或渠道，使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)能夠順利的從血液擴(kuò)散到周圍的組織或細(xì)胞中去?？偠灾?，細(xì)胞外基質(zhì)具備了組織工程支架材料的所有優(yōu)點(diǎn)。
　　 細(xì)胞外基質(zhì)是自身組織細(xì)胞分泌形成的功能性分子結(jié)構(gòu)，因此，由于組織來源的不同，細(xì)胞外基質(zhì)的組成成份也存在差異。來源于小腸粘膜下層的細(xì)胞外基質(zhì)材料(SIS-ECM)是最常被用到的，而成為

5、細(xì)胞外基質(zhì)的代表。干燥狀態(tài)下的SIS，其90％的成份是膠原，其中以Ⅰ型為主，另外，還有少量的Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ型膠原;膀胱細(xì)胞外基質(zhì)材料(UBM-ECM)與SIS的組成成份類似，但UBM中Ⅲ型膠原和Ⅶ型膠原共同存在，且后者是上皮基底膜的重要組成成份，這就使UBM和SIS在組成成份上明顯區(qū)別于其他組織來源的支架材料。SIS中包含了多種膠原、葡糖氨基聚糖類(GAGs)，生長因子等。GAGs在細(xì)胞外基質(zhì)內(nèi)含量的高低與脫細(xì)胞的方法有關(guān)，例如，去離子

6、劑是脫細(xì)胞過程中經(jīng)常用到的一種試劑，但這種試劑在脫細(xì)胞的同時，能夠去除細(xì)胞外基質(zhì)中的GAGs，從而使GAGs的含量減低。研究證實(shí)SIS內(nèi)含有粘附分子，例如:蛋白聚糖、層粘連蛋白和巢蛋白等。SIS中還含有多種生長因子，包括轉(zhuǎn)化生長因子、血管內(nèi)皮生長因子等，研究證實(shí)，這些生長因子即使經(jīng)過消毒處理或長期儲存，依然具有生物活性?？偠灾?，細(xì)胞外基質(zhì)是由多種不同的分子構(gòu)成的一個整體結(jié)構(gòu)，隨著組織來源的不同，其功能也可能會有所區(qū)別。
　　

7、目前，我們尚未完全認(rèn)識清楚細(xì)胞外基質(zhì)所具有的三維組織結(jié)構(gòu)，因此，在實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行簡單的合成是無法構(gòu)建出細(xì)胞外基質(zhì)材料的，但細(xì)胞外基質(zhì)中所包含的重要物質(zhì)成份，例如:膠原蛋白、層粘連蛋白、纖連蛋白和透明質(zhì)酸等，可以用人工的方法進(jìn)行分離提純，而且已經(jīng)證實(shí)這些重要成份無論在體內(nèi)還是體外，都能夠促進(jìn)細(xì)胞生長和分化。各種各樣的不同來源的細(xì)胞外基質(zhì)，被作為一種支架材料，廣泛的應(yīng)用于組織或器官的重建，例如:來源于小腸、皮膚、肝臟、胰腺和膀胱等組織或器

8、官。目前，諸如此類的細(xì)胞外基質(zhì)材料已經(jīng)形成商業(yè)化產(chǎn)品，并大范圍的應(yīng)用于臨床，例如:由豬小腸粘膜下層制成的ECM Oasis(Healthpoint公司)、Restore(DePuy公司)、CuffPatch(Arthrotek公司)，由人真皮制成的ECM Axis dermis（Mentor公司）、GraftJacket（Wright Medical Tech公司），由豬真皮制成的ECM Pelvicol（Bard公司）、Permaco

9、l(Tissue Science Laboratories公司)、Zimmer Collagen Patch(Tissue ScienceLaboratories公司)，由牛心包制成的ECM Vascu-Guard（Synovis Surgical公司）、Peri-Guard（Synovis Surgical公司）、Dura-Guard（Synovis Surgical公司），都已由美國食品和藥品管理局(US Food and Drug

10、 Administration，F(xiàn)DA)批準(zhǔn)上市，應(yīng)用于簡單或復(fù)雜的腹壁缺損的修補(bǔ)手術(shù)。
　　 目的:
　　 本實(shí)驗(yàn)以小鼠腹壁缺損為模型，通過對三種豬源性細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)—真皮基質(zhì)(P-ADM)、心包基質(zhì)(P-PC)以及豬小腸粘膜下層基質(zhì)(P-SIS)，體內(nèi)彈性纖維、葡糖氨基聚糖類(GAGs)、Ⅰ、Ⅲ型膠原的含量，以及Ⅰ/Ⅲ型膠原比例的測定，來對比研究三種生物材料植入體內(nèi)后的降解規(guī)律。
　　 方法:
　

11、　 第一部分:三種豬源性細(xì)胞外基質(zhì)的制備及其術(shù)后病理學(xué)評估。
　　 1.利用國際上傳統(tǒng)的脫細(xì)胞方法制備三種豬源性細(xì)胞外基質(zhì)材料。
　　 2.動物實(shí)驗(yàn):
　　 清潔級小鼠，數(shù)量共60只，約18-20 g重，單籠喂養(yǎng)，建立小鼠腹壁全層缺損模型，隨機(jī)分為3組(n=20)，分別以同樣大小的上述三種基質(zhì)材料進(jìn)行修復(fù)，于術(shù)后4周、8周進(jìn)行取材評估。
　　 3.檢測指標(biāo):(1).動物術(shù)后一般情況。(2).腹腔內(nèi)粘連程

12、度評分。(3).組織病理學(xué)檢測。
　　 第二部分:三種豬源性細(xì)胞外基質(zhì)植入動物體內(nèi)后降解規(guī)律的研究。
　　 1.動物實(shí)驗(yàn):清潔級小鼠，數(shù)量共60只，約18-20 g重，單籠喂養(yǎng)，建立小鼠腹壁全層缺損模型，隨機(jī)分為3組(n=20)，分別以同樣大小的上述三種基質(zhì)材料進(jìn)行修復(fù)，于術(shù)后4周、8周進(jìn)行取材評估。
　　 2.檢測指標(biāo):彈性纖維、葡糖氨基聚糖類、Ⅰ、Ⅲ型膠原的含量變化情況，以及Ⅰ/Ⅲ型膠原比例的變化情況。

13、>　　 結(jié)果:
　　 實(shí)驗(yàn)動物術(shù)中因麻醉意外死亡1條，其余個體都得以存活，至術(shù)后8周時，三組材料修復(fù)區(qū)修復(fù)效果較好，未見瘺、感染等并發(fā)癥。術(shù)后P-SIS組的腹腔內(nèi)粘連評分均低于同時期內(nèi)的其余兩組。術(shù)后4、8周比較:P-ADM組，GAGs含量減少(P＜0.01);PC組，彈性纖維(P＜0.01)、Ⅲ型膠原及GAGs數(shù)值上呈現(xiàn)上升趨勢，后二者P值都是P＜0.05; P-SIS組，彈性纖維(P＜0.001)、GAGs(P＜0.05)