炎癥因子IL-23對(duì)小鼠骨髓來源巨噬細(xì)胞極化作用影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　巨噬細(xì)胞是機(jī)體固有免疫系統(tǒng)的重要組成成分，但其組織分布、分化程度以及外界激活因子的多樣性賦予了巨噬細(xì)胞復(fù)雜的異質(zhì)性與功能的多樣性。在組織微環(huán)境中，巨噬細(xì)胞的激活會(huì)受到多種因素的影響。病原體的入侵、體內(nèi)壞死的細(xì)胞及碎片、其它細(xì)胞分泌的因子等刺激，均可使巨噬細(xì)胞的吞噬能力、細(xì)胞因子及趨化因子分泌能力、抗腫瘤能力、對(duì)趨化因子做出應(yīng)答以及對(duì)抗原的加工遞呈能力等發(fā)生明顯變化。本實(shí)驗(yàn)著重研究巨噬細(xì)胞對(duì)炎癥因子刺激發(fā)生的表型變化，明

2、確IL-23對(duì)經(jīng)體外誘導(dǎo)建立的M2型骨髓來源巨噬細(xì)胞極化作用的影響。探討在IL-23作用下，表型發(fā)生變化后的M2型巨噬細(xì)胞對(duì)黑色素瘤細(xì)胞體外增殖和侵襲的影響，為以巨噬細(xì)胞再極化為靶點(diǎn)的腫瘤免疫治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)與新思路。
　　方法:
　　體外分離培養(yǎng)C57BL小鼠骨髓來源巨噬細(xì)胞，分別加入誘導(dǎo)因子IL-4、M-CSF和B16F10非接觸共培養(yǎng)建立三種M2型巨噬細(xì)胞模型，在此基礎(chǔ)上，觀察施加炎癥因子IL-23干擾后，三種M2型巨

3、噬細(xì)胞形態(tài)、分泌因子、細(xì)胞代謝和細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)水平的變化:倒置顯微鏡下觀察在不同細(xì)胞因子刺激下，巨噬細(xì)胞形態(tài)變化;ELISA技術(shù)檢測(cè)三種M2型巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子表達(dá)情況，以及IL-23處理后分泌細(xì)胞因子表達(dá)水平的異同;Western blot技術(shù)檢測(cè)三種M2型巨噬細(xì)胞精氨酸代謝相關(guān)酶類表達(dá)量，以及IL-23處理后表水平的變化;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)三種M2型巨噬細(xì)胞相關(guān)特異性細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)量，以及IL-23處理后表達(dá)水平的變化。MTT

4、增殖實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)IL-23處理后的M2型巨噬細(xì)胞上清對(duì)黑色素瘤B16F10細(xì)胞增殖能力和侵襲能力的影響。MTT增殖實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)IL-23對(duì)黑色素瘤B16F10細(xì)胞增殖能力和侵襲能力的影響。
　　結(jié)果:
　　第一部分:IL-23對(duì)M2型巨噬細(xì)胞表型的影響。
　　三種M2型巨噬細(xì)胞模型經(jīng)一定濃度IL-23處理后，細(xì)胞形態(tài)由纖維梭形向煎蛋樣形態(tài)（M1型形態(tài)）轉(zhuǎn)變;Elisa檢測(cè)IL-2

5、3處理后三種M2型巨噬細(xì)胞分泌因子變化，由IL-10highIL-12lowTNF-α low轉(zhuǎn)變?yōu)镮L-10low IL-12highTNF-α high;Western Blot顯示IL-23下調(diào)M2型巨噬細(xì)胞精氨酸酶（Arginase，Arg-1）的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)誘導(dǎo)性一氧化氮合酶(Inducible nitric-oxide synthase，iNOS)的表達(dá)(P＜0.01)，精氨酸代謝向M1型方向轉(zhuǎn)化;流式細(xì)胞術(shù)分析顯示IL-

6、23下調(diào)M2巨噬細(xì)胞特異表面標(biāo)志物CD206(P＜0.01)，并上調(diào)CD16/32(P＜0.05)和MHC-Ⅱ(P＜0.01)的表達(dá)。綜上，經(jīng)IL-23處理后，三種M2型巨噬細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)、分泌因子種類、細(xì)胞代謝和細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)水平均表明細(xì)胞已向M1型轉(zhuǎn)化，其是否對(duì)腫瘤細(xì)胞具有殺傷作用有待下一步研究。
　　第二部分: IL-23處理后M2型巨噬細(xì)胞對(duì)小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16F10體外增殖、侵襲能力的影響。
　　根據(jù)第一部分

7、實(shí)驗(yàn)結(jié)果，收集對(duì)照組M2型巨噬細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)組（IL-23處理組）巨噬細(xì)胞上清，并設(shè)置單純血清為空白組檢測(cè)其對(duì)黑色素瘤細(xì)胞B16F10增殖的影響。改良Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其對(duì)黑色素瘤細(xì)胞B16F10侵襲能力的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)顯示與單純血清組相比，M2型巨噬細(xì)胞可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，IL-23處理過后的M2型巨噬細(xì)胞上清抑制B16細(xì)胞增殖(P＜0.05)，這一效應(yīng)與TNF-α的分泌相關(guān);改良Transwell侵襲實(shí)

8、驗(yàn)顯示IL-23處理過后的M2型巨噬細(xì)胞與對(duì)照組相比，穿入下室細(xì)胞數(shù)顯著減少(P＜0.01)。提示IL-23在改變巨噬細(xì)胞表型的同時(shí)，也恢復(fù)了M1型巨噬細(xì)胞的抗腫瘤免疫特性。
　　第三部分:IL-23對(duì)小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16F10體外增殖、侵襲的影響
　　多數(shù)細(xì)胞因子以自分泌形式發(fā)揮效應(yīng)，即主要作用于產(chǎn)生細(xì)胞本身和（或）臨近細(xì)胞，在局部發(fā)揮效應(yīng)。其生物功能除參與免疫調(diào)節(jié)外，可直接作用于腫瘤細(xì)胞自身，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖與侵襲。

9、本部分選擇炎癥因子IL-23和黑色素瘤B16F10細(xì)胞進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)研究，通過培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞，施加IL-23影響，觀察其對(duì)B16F10細(xì)胞增殖、侵襲能力的直接作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:與對(duì)照組相比，IL-23處理組B16F10細(xì)胞穿膜數(shù)明顯增多（P＜0.01）;腫瘤細(xì)胞MMP-2和MMP-9的表達(dá)活性增強(qiáng)(P＜0.01);B16細(xì)胞的增殖能力未見明顯變化。
　　結(jié)論：
　　本研究通過體外建立三種M2型巨噬細(xì)胞模型，應(yīng)用Elisa、We

10、stern Blot、以及流式細(xì)胞術(shù)等技術(shù)，觀察炎癥因子IL-23對(duì)其表型變化的影響，并通過體外實(shí)驗(yàn)觀察轉(zhuǎn)變后巨噬細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的影響，主要結(jié)論如下:
　　1、IL-23可促進(jìn)M2巨噬細(xì)胞向M1型轉(zhuǎn)化，本實(shí)驗(yàn)中的具體表型為TNF-α highIL-12high IL-10low，iNOS高表達(dá)，CD16/32和MHC-Ⅱ表達(dá)陽性細(xì)胞比例升高。
　　2、IL-23處理過后的M2型巨噬細(xì)胞可分泌具有細(xì)胞毒性的介質(zhì)（TNF-α、N