異氟烷對小鼠巨噬細胞胞葬作用及肺部炎癥恢復(fù)的影響.pdf

1、第一部分異氟烷預(yù)處理對小鼠巨噬細胞胞葬作用的影響
　　目的：本研究從體內(nèi)實驗和體外實驗觀察吸入麻醉藥異氟烷預(yù)處理對巨噬細胞胞葬作用的影響。
　　方法：從小鼠體內(nèi)提取骨髓衍生的巨噬細胞（BMDM）、肺泡巨噬細胞和中性粒細胞體外培養(yǎng)；用不同濃度0.5MAC、1MAC和2MAC的異氟烷預(yù)處理1h，用熒光染色的方法在體外監(jiān)測BMDM和肺泡巨噬細胞對凋亡中性粒細胞的吞噬情況；在體內(nèi)實驗，方案一:隨機分為三組，CON組、BMDM組和IS

2、O組，首先用CLOD去除三組小鼠肺內(nèi)肺泡巨噬細胞，2天后，CON組小鼠氣管內(nèi)滴入相同體積的生理鹽水，而BMDM組和ISO組小鼠氣管內(nèi)滴入LPS（3.5mg/kg），5天后給予CON組小鼠氣管內(nèi)相同體積的生理鹽水，給予BMDM組小鼠氣管內(nèi)滴入BMDM（2×106，40μL），給予ISO組小鼠氣管內(nèi)1MAC異氟烷預(yù)處理后BMDM（2×106，40μL）；方案二，隨機分為CON組、LPS組和LPS+ISO組，給予CON組小鼠氣管內(nèi)相同體積的生

3、理鹽水，給予LPS組和LPS+ISO組小鼠氣管內(nèi)滴入LPS（3.5mg/kg），3天后給予LPS+ISO組小鼠吸入1MAC異氟烷1h,其他各組小鼠吸入空氣。2h后后收集兩種方案中三組小鼠肺泡灌洗液，通過甩片，用Diff-quick染色監(jiān)測巨噬細胞對凋亡中性粒細胞的吞噬情況。
　　結(jié)果：體外研究發(fā)現(xiàn)，與未處理組比較，1MAC和2MAC異氟烷預(yù)處理的小鼠BMDM細胞對凋亡細胞清除能力明顯增強，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。而0.

4、5MAC異氟烷對小鼠BMDM細胞與未處理組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。1MAC異氟烷預(yù)處理的小鼠肺泡巨噬細胞對凋亡細胞清除能力明顯增強，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，用濃度為1MAC異氟烷預(yù)處理的小鼠BMDM細胞1h后，BMDM細胞在肺里對中性粒細胞的吞噬功能明顯高于未處理組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。與未處理組比較，用1MAC異氟烷處理后可以增強小鼠肺泡巨噬細胞對中性粒細胞的吞噬能力明顯增高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意

5、義（P<0.05）。
　　結(jié)論：體外實驗結(jié)果顯示，1MAC吸入麻醉藥異氟烷預(yù)處理1h可以增強小鼠BMDM細胞和肺泡巨噬細胞對凋亡細胞的清除能力即增強小鼠巨噬細胞的胞葬作用；體內(nèi)研究結(jié)果顯示1MAC吸入麻醉藥異氟烷處理后可以增強小鼠BMDM細胞的對凋亡細胞的清除能力，也可以增加小鼠肺內(nèi)肺泡巨噬細胞的吞噬能力。
　　第二部分異氟烷預(yù)處理對小鼠巨噬細胞胞葬作用機制的研究
　　目的：觀察吸入麻醉藥異氟烷對BMDM細胞Mer蛋白

6、表達變化、ADAM17的蛋白變化和AMPK的磷酸化變化的影響，探討吸入麻醉藥異氟烷預(yù)處理對小鼠BMDM巨噬細胞胞葬作用機制。
　　方法：用不同濃度0.5MAC、1MAC和2MAC的異氟烷預(yù)處理BMDM細胞后，提取細胞內(nèi)總蛋白，用免疫蛋白印記的方法檢測總蛋白Mer的變化；1MAC異氟烷預(yù)處理BMDM細胞后，處理后分別在0h、0.5h、1h、1.5h和2h，提取總蛋白、膜蛋白、細胞質(zhì)蛋白和收集上清液中蛋白，用免疫蛋白印記的技術(shù)監(jiān)測總蛋

7、白、膜蛋白、細胞質(zhì)蛋白和收集上清液中蛋白中蛋白Mer的變化；總蛋白、膜蛋白和細胞質(zhì)蛋白中ADAM17的蛋白變化；及總蛋白中AMPK的激活情況；通過先加入AMPK抑制劑Compound C25μM或者用siRNA干擾沉默AMPK，后用1MAC異氟烷預(yù)處理細胞，觀察細胞內(nèi)Mer蛋白的變化情況、ADAM17的蛋白變化和AMPK的磷酸化情況；通過用siRNA干擾沉默BMDM細胞內(nèi)AMPK，觀察異氟烷預(yù)處理對AMPK基因沉默后的BMDM細胞，觀察

8、BMDM細胞胞葬作用的變化。
　　結(jié)果：與未處理組比較，1MAC和2MAC異氟烷預(yù)處理組可以誘導(dǎo)BMDM細胞中Mer含量增加，具有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）。0.5MAC異氟烷處理組和未處理組比較，兩組細胞內(nèi)Mer蛋白含量差異無統(tǒng)計意義；與未處理組比較，1MAC異氟烷預(yù)處理后1h、1.5h和2h，BMDM細胞總蛋白中Mer蛋白明顯增加，膜蛋白Mer蛋白中增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），細胞質(zhì)中Mer蛋白各時間點的變

9、化無統(tǒng)計學(xué)差異，細胞培養(yǎng)液中的可溶性Mer蛋白明顯降低（P<0.05）；總蛋白中ADAM17蛋白含量無明顯變化，膜蛋白中ADAM17的含量明顯減少，細胞質(zhì)中ADAM17的含量明顯增加（P<0.05）；與未處理組細胞內(nèi)的AMPK的磷酸化水平比較，異氟烷預(yù)處理后0.5h、1h、1.5h和2h細胞內(nèi)的AMPK的磷酸化含量有增加趨勢，具有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）；AMPK激酶的抑制劑化合物Compound C能夠抑制BMDM細胞AMPK

10、的磷酸化水平，抑制Mer蛋白在BMDM細胞總蛋白中、膜蛋白水平增加，抑制ADAM17在膜蛋白中的減少，具有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）。應(yīng)用干擾技術(shù)沉默BMDM細胞AMPK后，可以明顯抑制BMDM細胞Mer蛋白的表達（P<0.05）。通過沉默BMDM細胞AMPK后，能抑制異氟烷增強BMDM的胞葬作用，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。
　　結(jié)論：吸入麻醉藥異氟烷可以誘導(dǎo)BMDM細胞中的AMPK的磷酸化,減少細胞膜蛋白ADAM

11、17的含量，從而影響ADAM17的功能，抑制可溶性蛋白Mer的生成，導(dǎo)致巨噬細胞膜蛋白Mer的增加,增強巨噬細胞的胞葬作用。
　　第三部分異氟烷對脂多糖誘導(dǎo)小鼠肺炎癥損傷的恢復(fù)的影響
　　目的：探討吸入麻醉藥異氟烷預(yù)處理對脂多糖誘導(dǎo)的小鼠肺炎癥損傷恢復(fù)的影響。
　　方法：通過建立脂多糖誘導(dǎo)小鼠肺損傷模型，方案一，小鼠隨機分為五組：空白對照（CON）組；經(jīng)氣管給予等體積的生理鹽水；脂多糖（LPS）組，滴入LPS（3.5m

12、g/kg）經(jīng)氣管內(nèi)刺激；CLOD+LPS組，先提前2d用CLOD打掉肺泡巨噬細胞，后氣管內(nèi)滴入LPS（3.5mg/kg）刺激；CLOD+LPS+BMDM-CON組，先提前2d用CLOD打掉肺泡巨噬細胞，后氣管內(nèi)滴入LPS（3.5mg/kg）刺激，刺激后3d后氣管內(nèi)滴入BMDM細胞2×106（40μL）；CLOD+ LPS+BMDM-ISO組，先提前2d用CLOD打掉肺泡巨噬細胞，后氣管內(nèi)滴入LPS（3.5mg/kg）刺激，刺激后3d，后

13、氣管內(nèi)滴入用異氟烷處理過的BMDM細胞107（40μL）。方案二：空白對照組；脂多糖（LPS）組，氣管內(nèi)滴入LPS（3.5mg/kg）刺激；LPS+ISO組;氣管內(nèi)滴入LPS（3.5mg/kg）刺激，刺激后3d，給小鼠吸入異氟烷1h。兩種方案于LPS刺激之后1、3、5、7和9d收集肺組織標(biāo)本和相應(yīng)的肺泡灌洗液，進行監(jiān)測肺泡灌洗液中中性粒細胞、蛋白和細胞因子的變化及肺組織內(nèi)MPO、肺葉濕干比及肺組織的切片的變化。在方案一的基礎(chǔ)上增加一組C

14、LOD+LPS+BMDM（AMPKsiRNA）-ISO組,觀察脂多糖刺激后第五天，肺泡灌洗液中TNF-α、白介素-6、TGF-β和白介素-10的水平變化。
　　結(jié)果：在脂多糖刺激小鼠后5、7和9d，CLOD+LPS+BMDM-CON組和CLOD+ LPS+BMDM-ISO組肺泡灌洗液中的中性粒細胞數(shù)目、灌洗液中蛋白、TNF-α和IL-6含量及顯著低于CLOD+ LPS組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。與CLOD+LPS+BM

15、DM-CON組比較，CLOD+LPS+BMDM-ISO組肺泡灌洗液中的中性粒細胞數(shù)目、灌洗液中蛋白、TNF-α和IL-6含量下降更加顯著，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；CLOD+ LPS+BMDM-CON組和CLOD+ LPS+BMDM-ISO組肺組織內(nèi)MPO變化和肺組織濕干比顯著低于CLOD+LPS組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。與CLOD+LPS+BMDM-CON組比較，CLOD+LPS+BMDM-ISO組肺組織內(nèi)MP

16、O變化和肺組織濕干比下降更加顯著，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；CLOD+ LPS+BMDM-CON組和CLOD+ LPS+BMDM-ISO組肺泡灌洗液中TGF-β和IL-10含量顯著高于CLOD+LPS組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。與CLOD+LPS+BMDM-CON組比較，CLOD+LPS+BMDM-ISO組肺泡灌洗液中TGF-β和IL-10含量顯著增高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。脂多糖刺激后5d肺組織切片

17、HE染色結(jié)果顯示CLOD+LPS+BMDM-CON組和CLOD+LPS+BMDM-ISO組肺組織損傷評分顯著低于CLOD+LPS組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。與CLOD+LPS+BMDM-CON組比較，CLOD+LPS+BMDM-ISO組肺組織損傷評分比較低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。按照第二種方案處理結(jié)果：在脂多糖刺激小鼠后5、7和9d，LPS+ISO組肺泡灌洗液中的中性粒細胞數(shù)目、灌洗液中蛋白水平、TNF-α和白

18、介素-6含量顯著低于LPS組（P<0.05）。LPS+ISO組肺組織內(nèi)MPO變化和肺組織濕干比顯著低于LPS組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。LPS+ISO組肺泡灌洗液中TGF-β和IL-10含量顯著高于LPS組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。肺組織切片HE染色結(jié)果顯示LPS+ISO組肺組織損傷評分顯著低于LPS組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。與CLOD+LPS+BMDM-ISO組相比，CLOD+LPS+BMDM（A