蓯蓉總苷和松果菊苷對體內(nèi)外氧化應(yīng)激阿爾茨海默病模型的作用及機(jī)理研究.pdf

1、阿爾茨海默病(Alzheimer's Disease，AD)是常發(fā)于老年人的一種癡呆性疾病，其主要病理特征為相對特異性的老年斑生成、神經(jīng)元纖維纏結(jié)和神經(jīng)元的丟失。研究表明，氧化應(yīng)激與AD病理過程密切相關(guān)。H202或氧自由基是機(jī)體正?；虍惓４x過程如β淀粉樣蛋白聚集、多巴胺氧化和腦缺血再灌注的產(chǎn)物。生成的H2O2可以轉(zhuǎn)變?yōu)楦叨拘缘淖杂苫舻鞍踪|(zhì)、核酸和生物膜，導(dǎo)致線粒體損傷和鈣超載等現(xiàn)象，誘發(fā)神經(jīng)元走向凋亡。所以近年來已將氧化應(yīng)激引起的

2、神經(jīng)退行性病變和細(xì)胞凋亡置于AD研究的中心位置，并將從天然產(chǎn)物中尋找具有抗氧化活性和抗自由基損傷的有效物質(zhì)作為開發(fā)抗AD新藥的重要途徑。 蓯蓉總苷是從管花肉蓯蓉中提取得到的苯乙醇苷，蓯蓉總苷膠囊由杏輝天力(杭州)藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，為SFDA批準(zhǔn)的第一個以苯乙醇苷類化合物為主要成分的中藥，對血管性癡呆的癥狀具有顯著緩解作用。研究表明，蓯蓉總苷具有抗氧化和神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用。松果菊苷是1950年第一個從狹葉紫錐菊中分離得到的苯乙醇苷類

3、化合物，是蓯蓉總苷的主要成分(含量>25％)和主要的質(zhì)量控制指標(biāo)，也存在于其它植物中。研究表明，松果菊苷能保護(hù)肝損傷，對TNF-α誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡和6-羥基多巴胺引起的急性大鼠紋狀體細(xì)胞損傷具有一定的保護(hù)作用。但有關(guān)其體外對氧化應(yīng)激所致神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用研究很少。 本研究擬從氧化應(yīng)激的角度分別利用整體動物模型和體外細(xì)胞模型研究蓯蓉總苷及其主要成分松果菊苷對氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用和機(jī)理，為闡明蓯蓉總苷的部分作用機(jī)制

4、和開發(fā)利用松果菊苷提供依據(jù)。具體內(nèi)容和結(jié)果如下： 1.蓯蓉總苷可以明顯改善D-半乳糖聯(lián)合亞硝酸鈉所致AD小鼠的學(xué)習(xí)記憶，提高小鼠或大鼠腦內(nèi)Na+-K+ATPase、GSH-Px和SOD的活性，降低NO的含量。 2.MTT法檢測結(jié)果顯示，松果菊苷可以明顯提高H2O2損傷的PC12細(xì)胞存活率；流式細(xì)胞術(shù)和Hoechst33342染色法形態(tài)觀察結(jié)果表明，松果菊苷可以顯著降低H2O2損傷PC12細(xì)胞的凋亡和壞死率，改善DNA片斷

5、化和核固縮，有抗PC12細(xì)胞凋亡作用；松果菊苷可以降低H2O2損傷PC12細(xì)胞LDH的滲漏。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，松果菊苷對H2O2損傷的PC12細(xì)胞具有明顯的保護(hù)作用。 3.在H2O2損傷PC12細(xì)胞模型上，檢測了Na+-K+ATPase，GSH-Px和Caspase-3三種酶活性的變化。研究發(fā)現(xiàn)，松果菊苷提高損傷細(xì)胞的Na+-k+ATPase，GSH-Px的活性，但降低Caspase-3的活性。 4.Rhodamine1

6、23和DCF-DA熒光染料結(jié)合流式細(xì)胞技術(shù)檢測結(jié)果表明，松果菊苷可以顯著升高損傷細(xì)胞的線粒體膜電位(MMP)，降低細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平。 5.Fluo-3和DAF熒光染料結(jié)合激光共聚焦檢測結(jié)果顯示，H2O2損傷的細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i和NO顯著升高，時程曲線上移。松果菊苷可以使損傷細(xì)胞內(nèi)的[Ca2+]i和NO升高的速度和幅度都明顯減緩，峰值降低。表明降低細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i和NO與松果菊苷抑制PC12細(xì)胞凋亡的作用密切相關(guān)。

7、 6.本實(shí)驗(yàn)用JC-1結(jié)合共聚焦技術(shù)進(jìn)一步研究氧化損傷過程中PC12細(xì)胞MMP的變化和松果菊苷的干預(yù)作用。研究發(fā)現(xiàn)，用每個細(xì)胞的JC-1紅色熒光強(qiáng)度和綠色熒光強(qiáng)度的比值(R)的變化值(R0/Rt)最能體現(xiàn)MMP的變化，未見文獻(xiàn)報道。200μM H2O2使細(xì)胞R0/Rt變大，松果菊苷預(yù)處理使R0/Rt變小，說明MMP升高。 7.Western blot檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，氧化損傷后PC12細(xì)胞Bcl-2低表達(dá)但Bax高表達(dá)，Ba

8、x/Bcl-2升高，松果菊苷處理有效抑制了H2O2的作用，使Bcl-2蛋白和Bax蛋白的表達(dá)回復(fù)到大約原來的水平，Bax/Bcl-2降低，說明抑制Bax表達(dá)和增強(qiáng)Bcl-2表達(dá)是松果菊苷抑制PC12細(xì)胞凋亡的重要機(jī)制之一。 8.RT-PCR半定量分析顯示，PC12細(xì)胞在H2O2作用下，Bcl-2 mRNA表達(dá)顯著降低，p53 mRNA、p65-2 mRNA和iNOS mRNA表達(dá)明顯升高。松果菊苷可以拮抗H2O2的作用，逆轉(zhuǎn)上述

9、基因的表達(dá)，從而起到抗凋亡的作用。 本研究得出以下結(jié)論：1.蓯蓉總苷可以改善D-半乳糖聯(lián)合亞硝酸鈉AD模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶，部分作用機(jī)理為提高腦內(nèi)Na+-K+ATPase、GSH-Px和SOD的活性，降低NO的含量。2.松果菊苷對H2O2損傷的PC12細(xì)胞損傷和凋亡具有明顯的保護(hù)作用，升高Na+-K+ATPase,GSH-Px的活性和MMP、降低細(xì)胞內(nèi)ROS、Ca2+以及NO水平、上調(diào)Bcl-2蛋白和mRNA表達(dá)但下調(diào)p53、p6