B淋巴細(xì)胞刺激因子克隆、表達(dá)及其時(shí)間分辨熒光免疫方法的建立.pdf_第1頁(yè)
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1、B淋巴細(xì)胞刺激因子(BLyS)是1999年發(fā)現(xiàn)的TNF超家族新成員,它在B淋巴細(xì)胞的存活、分化、成熟等生理過(guò)程中起著重要的調(diào)節(jié)作用,而過(guò)量表達(dá)的BLyS則與自身免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān),因此BLyS受到基礎(chǔ)研究者和臨床研究者的青睞。而BLyS在正常人和病人血清中的含量甚微,所以建立一種高效靈敏的檢測(cè)手段成為研究BLyS中的一項(xiàng)重要內(nèi)容。 在眾多的標(biāo)記免疫分析技術(shù)中,時(shí)間分辨熒光免疫分析技術(shù)(TRFIA)因具有本底極低、靈敏

2、度高、重復(fù)性好、特異性強(qiáng)、線性范圍寬和應(yīng)用廣泛等特點(diǎn)而成為當(dāng)前最有前景的超靈敏免疫分析技術(shù)之一。用TRFIA來(lái)分析血清中的BlyS水平將為臨床進(jìn)行定量研究創(chuàng)造條件。 該研究首先以原核方式克隆、表達(dá)了重組人BlyS,然后以重組人作為標(biāo)準(zhǔn)品,建立了檢測(cè)人血清中BLyS的時(shí)間分辨熒光免疫分析方法,并對(duì)其作了方法學(xué)評(píng)價(jià)。 第一部分 人外周血單個(gè)核細(xì)胞中BLyS127-285的克隆和表達(dá) 根據(jù)BlyS基因序列合成

3、特異性引物,并利用RT-PCR的技術(shù)從人外周血單個(gè)核細(xì)胞中克隆出BlyS基因的胞外區(qū)BLyS127-285cDNA,通過(guò)瓊脂糖電泳分析PCR產(chǎn)物,膠回收目的基因片斷,連接到pGEM-T克隆載體中,轉(zhuǎn)化大腸桿菌,酶切分析陽(yáng)性克隆,將陽(yáng)性克隆質(zhì)粒命名為BlyS-pGEM-T。經(jīng)DNA測(cè)序儀鑒定序列,結(jié)果顯示重組質(zhì)粒中的目的片斷與GenBank中的cDNA序列完全一致。將測(cè)序正確的BlyS-pGEM-T和表達(dá)載體pQE-30進(jìn)行雙酶切,將目的

4、基因片斷亞克隆至pQE-30中,然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,經(jīng)酶切鑒定,將陽(yáng)性克隆質(zhì)粒命名為BLyS-pQE-30。然后用1mmol/l的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)時(shí)間的優(yōu)化,同時(shí)將表達(dá)的重組人BlyS127-285進(jìn)行SDS-PAGE和western-blot鑒定,結(jié)果攜帶BLyS-pQE-30的大腸桿菌DH5α菌株,經(jīng)IPIG誘導(dǎo)表達(dá)了重組目的蛋白,主要位于菌體包涵體內(nèi),其相對(duì)分子質(zhì)量約為19000,表達(dá)量可達(dá)菌體總蛋白的49.8%。將將含重組

5、質(zhì)粒BLyS-pQE-30的大腸桿菌DH5α擴(kuò)大培養(yǎng),1mmol/LIPTG37℃誘導(dǎo)表達(dá)4h。用包涵體溶解緩沖液將收集的細(xì)胞進(jìn)行超聲破碎,然后經(jīng)Ni-NTA層析柱進(jìn)行純化回收目的重組蛋白。最后將純化的目的蛋白進(jìn)行透析復(fù)性。 第二部分 BLyS時(shí)間分辯熒光免疫分析方法的建立 首先制備Eu3+-pAb:將山羊抗人BLyS多克隆抗體(pAb)經(jīng)PD-10柱轉(zhuǎn)換緩沖條件,與標(biāo)記試劑盒中的Eu3+-DTTA在碳酸鹽緩沖

6、液(pH8.5)中30℃進(jìn)行標(biāo)記20h,反應(yīng)液SepharoseCL-6B柱純化,結(jié)果pAb每個(gè)分子(IgG)平均標(biāo)記上4.26個(gè)Eu3+。經(jīng)檢定,標(biāo)記物-20℃保存三個(gè)月后其活性基本不變,非常穩(wěn)定。與進(jìn)口的增強(qiáng)液對(duì)比,自制的增強(qiáng)液具有良好的增強(qiáng)性能。然后對(duì)反應(yīng)的各個(gè)條件如:包被緩沖液種類、抗體包被濃度、包被溫度和時(shí)間、封閉溫度和時(shí)間、標(biāo)記物Eu3+-pAb的濃度、兩次反應(yīng)的溫度和時(shí)間等繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,對(duì)BLyS時(shí)間分辯熒光免疫分析方法進(jìn)

7、行優(yōu)化,在綜合考慮分析靈敏度和信噪比以及實(shí)用性角度的原則上選擇優(yōu)化方案。優(yōu)化后的BLyS時(shí)間分辯熒光免疫分析方法分析步驟為:用檸檬酸鹽緩沖液將mAb稀釋成20ug/ml,每孔加200ul,用封孔膜封閉后,4℃24h。洗滌液洗3次,每次浸泡30秒,扣干(下同)。每孔加350ul封閉緩沖液,4℃24h。洗滌液洗3次。每孔加200ul樣品或標(biāo)準(zhǔn)品,25℃低速振蕩孵育2h。洗滌液洗4次。每孔加用反應(yīng)緩沖液稀釋1000倍的pAb-Eu3+200u

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