B淋巴細胞刺激因子克隆、表達及其時間分辨熒光免疫方法的建立.pdf

1、B淋巴細胞刺激因子(BLyS)是1999年發(fā)現(xiàn)的TNF超家族新成員，它在B淋巴細胞的存活、分化、成熟等生理過程中起著重要的調節(jié)作用，而過量表達的BLyS則與自身免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關，因此BLyS受到基礎研究者和臨床研究者的青睞。而BLyS在正常人和病人血清中的含量甚微，所以建立一種高效靈敏的檢測手段成為研究BLyS中的一項重要內容。 在眾多的標記免疫分析技術中，時間分辨熒光免疫分析技術(TRFIA)因具有本底極低、靈敏

2、度高、重復性好、特異性強、線性范圍寬和應用廣泛等特點而成為當前最有前景的超靈敏免疫分析技術之一。用TRFIA來分析血清中的BlyS水平將為臨床進行定量研究創(chuàng)造條件。 該研究首先以原核方式克隆、表達了重組人BlyS，然后以重組人作為標準品，建立了檢測人血清中BLyS的時間分辨熒光免疫分析方法，并對其作了方法學評價。 第一部分 人外周血單個核細胞中BLyS127-285的克隆和表達 根據(jù)BlyS基因序列合成

3、特異性引物，并利用RT-PCR的技術從人外周血單個核細胞中克隆出BlyS基因的胞外區(qū)BLyS127-285cDNA，通過瓊脂糖電泳分析PCR產(chǎn)物，膠回收目的基因片斷，連接到pGEM-T克隆載體中，轉化大腸桿菌，酶切分析陽性克隆，將陽性克隆質粒命名為BlyS-pGEM-T。經(jīng)DNA測序儀鑒定序列，結果顯示重組質粒中的目的片斷與GenBank中的cDNA序列完全一致。將測序正確的BlyS-pGEM-T和表達載體pQE-30進行雙酶切，將目的

4、基因片斷亞克隆至pQE-30中，然后轉化大腸桿菌DH5α，經(jīng)酶切鑒定，將陽性克隆質粒命名為BLyS-pQE-30。然后用1mmol/l的IPTG進行誘導時間的優(yōu)化，同時將表達的重組人BlyS127-285進行SDS-PAGE和western-blot鑒定，結果攜帶BLyS-pQE-30的大腸桿菌DH5α菌株，經(jīng)IPIG誘導表達了重組目的蛋白，主要位于菌體包涵體內，其相對分子質量約為19000，表達量可達菌體總蛋白的49.8％。將將含重組

5、質粒BLyS-pQE-30的大腸桿菌DH5α擴大培養(yǎng)，1mmol/LIPTG37℃誘導表達4h。用包涵體溶解緩沖液將收集的細胞進行超聲破碎，然后經(jīng)Ni-NTA層析柱進行純化回收目的重組蛋白。最后將純化的目的蛋白進行透析復性。 第二部分 BLyS時間分辯熒光免疫分析方法的建立 首先制備Eu3+-pAb：將山羊抗人BLyS多克隆抗體(pAb)經(jīng)PD-10柱轉換緩沖條件，與標記試劑盒中的Eu3+-DTTA在碳酸鹽緩沖

6、液(pH8.5)中30℃進行標記20h，反應液SepharoseCL-6B柱純化，結果pAb每個分子(IgG)平均標記上4.26個Eu3+。經(jīng)檢定，標記物-20℃保存三個月后其活性基本不變，非常穩(wěn)定。與進口的增強液對比，自制的增強液具有良好的增強性能。然后對反應的各個條件如：包被緩沖液種類、抗體包被濃度、包被溫度和時間、封閉溫度和時間、標記物Eu3+-pAb的濃度、兩次反應的溫度和時間等繪制標準曲線，對BLyS時間分辯熒光免疫分析方法進

7、行優(yōu)化，在綜合考慮分析靈敏度和信噪比以及實用性角度的原則上選擇優(yōu)化方案。優(yōu)化后的BLyS時間分辯熒光免疫分析方法分析步驟為：用檸檬酸鹽緩沖液將mAb稀釋成20ug/ml，每孔加200ul，用封孔膜封閉后，4℃24h。洗滌液洗3次，每次浸泡30秒，扣干(下同)。每孔加350ul封閉緩沖液，4℃24h。洗滌液洗3次。每孔加200ul樣品或標準品，25℃低速振蕩孵育2h。洗滌液洗4次。每孔加用反應緩沖液稀釋1000倍的pAb-Eu3+200u