基于人工TALE技術(shù)的抗雙生病毒研究.pdf

1、雙生病毒是一類具有單鏈環(huán)狀DNA的植物病毒，已在多個國家和地區(qū)造成嚴(yán)重危害。但現(xiàn)有防治雙生病毒的策略都存在一定的缺陷，成效不顯著，因此，需要不斷研發(fā)抗雙生病毒新技術(shù)。類轉(zhuǎn)錄激活因子（Transcription-like effector，TALE）是植物致病菌黃單孢桿菌通過Ⅲ型分泌系統(tǒng)注入到寄主細(xì)胞內(nèi)的一類具有DNA結(jié)合活性的蛋白質(zhì)，根據(jù)其識別DNA序列的特征，近年來已迅速發(fā)展成有效的基因組編輯工具。因此，本文利用人工TALE蛋白進(jìn)行抗

2、雙生病毒研究。
　　以在我國發(fā)生危害最重、分布最廣的單組分雙生病毒——番茄黃曲葉病毒（Tomatoyellow leaf curl virus，TYLCV）為對象，通過與雙組份雙生病毒甘藍(lán)曲葉病毒（Cabbage leafcurl virus，CaLCuV）作比較，利用TALE在線工具h(yuǎn)ttps://boglab.plp.iastate.edu/分析TYLCV和CaLCuV的潛在靶點(diǎn)，根據(jù)天然TALE識別序列的特征、TALE靶點(diǎn)的

3、選擇原則和雙生病毒復(fù)制所需的重要元件，確定了TYLCV和CaLCuV的復(fù)制蛋白(Rep)結(jié)合位點(diǎn)作為人工抗雙生病毒TALE的靶點(diǎn)。利用Golden-Gate克隆法快速組裝分別針對TYLCV和CaLCuV的TALE質(zhì)粒，并通過酶切、測序和BLAST比對，成功構(gòu)建了分別針對TYLCV和CaLCuV的TALE質(zhì)粒pTAL1-L4和pTAL1-L5。
　　為了在體外驗(yàn)證人工TALE的活性，建立并優(yōu)化了TALE的原核表達(dá)與純化條件。根據(jù)前期

4、研究，設(shè)計(jì)并獲得了N端缺失152個氨基酸、C端保留46個氨基酸的截短的TYLCV-TALE-L4、CaLCuV-TALE-L5。進(jìn)一步將截短后的TYLCV-TALE-L4構(gòu)建到5種含有不同融合標(biāo)簽的表達(dá)載體上，在相同的條件下通過比較目的蛋白的表達(dá)量，確定TALE在pET-28a、pET-32a及pMBP三個表達(dá)載體上的表達(dá)效果較好。又將構(gòu)建在pET-32a的TALE轉(zhuǎn)化入4種不同的表達(dá)菌株中，發(fā)現(xiàn)表達(dá)載體在BL21(DE3)、 BL21

5、(DE3)-pLus及BL21(DE3)-Tf2表達(dá)菌株內(nèi)的表達(dá)效果較好。考慮到標(biāo)簽對融合蛋白大小的影響和實(shí)驗(yàn)操作步驟的簡便性，選擇了pET-28a表達(dá)載體以及BL21(DE3)表達(dá)菌株進(jìn)行L4和L5蛋白的大量誘導(dǎo)和純化，最終建立了分別針對TYLCV和CaLCuV的TALEs的高效原核表達(dá)體系。
　　為了研究人工TALEs的抗病毒活性，以TALE蛋白的靶向DNA序列為探針，將原核表達(dá)系統(tǒng)獲得的人工TALE蛋白與標(biāo)記過的探針進(jìn)行凝膠

6、阻滯實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)人工TALE蛋白L4可以特異性結(jié)合TYLCV相關(guān)序列，人工TALE蛋白L5可以特異性結(jié)合CaLCuV相關(guān)序列。進(jìn)一步將具有核定位信號的TALE構(gòu)建到帶有flag標(biāo)簽的pCAMBIA2300載體上，通過農(nóng)桿菌浸潤和Western雜交印記分析發(fā)現(xiàn)人工TALE蛋白能夠在植物中表達(dá)。將該表達(dá)載體與靶標(biāo)雙生病毒共浸潤后，在不同時間段提取植物可溶性蛋白和基因組DNA，利用Southern雜交印記分析，發(fā)現(xiàn)瞬時表達(dá)的人工TALE蛋白L4