基于人工TALE技術的抗雙生病毒研究.pdf

1、雙生病毒是一類具有單鏈環(huán)狀DNA的植物病毒，已在多個國家和地區(qū)造成嚴重危害。但現有防治雙生病毒的策略都存在一定的缺陷，成效不顯著，因此，需要不斷研發(fā)抗雙生病毒新技術。類轉錄激活因子（Transcription-like effector，TALE）是植物致病菌黃單孢桿菌通過Ⅲ型分泌系統(tǒng)注入到寄主細胞內的一類具有DNA結合活性的蛋白質，根據其識別DNA序列的特征，近年來已迅速發(fā)展成有效的基因組編輯工具。因此，本文利用人工TALE蛋白進行抗

2、雙生病毒研究。
　　以在我國發(fā)生危害最重、分布最廣的單組分雙生病毒——番茄黃曲葉病毒（Tomatoyellow leaf curl virus，TYLCV）為對象，通過與雙組份雙生病毒甘藍曲葉病毒（Cabbage leafcurl virus，CaLCuV）作比較，利用TALE在線工具https://boglab.plp.iastate.edu/分析TYLCV和CaLCuV的潛在靶點，根據天然TALE識別序列的特征、TALE靶點的

3、選擇原則和雙生病毒復制所需的重要元件，確定了TYLCV和CaLCuV的復制蛋白(Rep)結合位點作為人工抗雙生病毒TALE的靶點。利用Golden-Gate克隆法快速組裝分別針對TYLCV和CaLCuV的TALE質粒，并通過酶切、測序和BLAST比對，成功構建了分別針對TYLCV和CaLCuV的TALE質粒pTAL1-L4和pTAL1-L5。
　　為了在體外驗證人工TALE的活性，建立并優(yōu)化了TALE的原核表達與純化條件。根據前期

4、研究，設計并獲得了N端缺失152個氨基酸、C端保留46個氨基酸的截短的TYLCV-TALE-L4、CaLCuV-TALE-L5。進一步將截短后的TYLCV-TALE-L4構建到5種含有不同融合標簽的表達載體上，在相同的條件下通過比較目的蛋白的表達量，確定TALE在pET-28a、pET-32a及pMBP三個表達載體上的表達效果較好。又將構建在pET-32a的TALE轉化入4種不同的表達菌株中，發(fā)現表達載體在BL21(DE3)、 BL21

5、(DE3)-pLus及BL21(DE3)-Tf2表達菌株內的表達效果較好。考慮到標簽對融合蛋白大小的影響和實驗操作步驟的簡便性，選擇了pET-28a表達載體以及BL21(DE3)表達菌株進行L4和L5蛋白的大量誘導和純化，最終建立了分別針對TYLCV和CaLCuV的TALEs的高效原核表達體系。
　　為了研究人工TALEs的抗病毒活性，以TALE蛋白的靶向DNA序列為探針，將原核表達系統(tǒng)獲得的人工TALE蛋白與標記過的探針進行凝膠

6、阻滯實驗，發(fā)現人工TALE蛋白L4可以特異性結合TYLCV相關序列，人工TALE蛋白L5可以特異性結合CaLCuV相關序列。進一步將具有核定位信號的TALE構建到帶有flag標簽的pCAMBIA2300載體上，通過農桿菌浸潤和Western雜交印記分析發(fā)現人工TALE蛋白能夠在植物中表達。將該表達載體與靶標雙生病毒共浸潤后，在不同時間段提取植物可溶性蛋白和基因組DNA，利用Southern雜交印記分析，發(fā)現瞬時表達的人工TALE蛋白L4