幽門螺桿菌cheA基因在細菌體外趨化和體內定植過程中的作用.pdf

1、背景和目的：幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)是多種人胃炎和消化性潰瘍的病原體,持續(xù)感染則與胃腺癌、胃粘膜相關淋巴組織淋巴瘤及原發(fā)性胃非何杰金淋巴瘤發(fā)病密切相關[1,2]。在致病過程中,病原菌必然能感知并通過定向運動也即趨化(chemotaxis)到達合適的寄生部位進行定植(colonization),然后大量繁殖引起疾病[3]。有文獻報道,在有鞭毛的病原菌中,鞭毛提供細菌動力,但趨化運動受二元信號傳導系統(tǒng)(two-c

2、omponent signaling system,TCSS)調控[4-7]。TCSS通常由跨膜組氨酸蛋白激酶(histidine protein kinase,HK)和胞漿反應調節(jié)蛋白(response regulator protein,RR)組成[8]。在幽門螺稈菌基因組中,存在趨化相關TCSS(Che-TCSS)HK編碼基因cheA及RR編碼基因cheY[8],但作為Che-TCSS的CheA/CheY在該菌體外趨化和宿主體內定

3、植中的作用,迄今未見文獻報道。
　　 我們以往研究結果證實,H離子是誘導幽門螺桿菌趨化的信號分子,同時建立了幽門螺桿菌體外趨化模型[9]。本研究中,我們根據同源重組交換原理,采用基于自殺質粒的基因敲除技術構建了幽門螺桿菌NCTC11637株cheA基因敲除突變株(cheA),然后分別采用幽門螺桿菌體外趨化模型及小鼠感染模型等生物學試驗,探討了cheA基因在幽門螺桿菌趨化和定植中的作用。
　　 實驗方法：從幽門螺桿菌NCT

4、C11637株基因組DNA中擴增并克隆全長cheA和cheY基因。構建該兩個基因原核表達系統(tǒng),Ni-NTA親和層析法提取目的重組蛋白rCheA和rCheY。rCheA和rCheY免疫家兔制備抗血清,采用硫酸銨沉淀法及DEAE-52柱層析法制備rCheA-IgG和rCheY-IgG。構建cheA基因自殺質粒,根據同源重組交換原理利用該自殺質粒構建cheA基因敲除突變株(cheA),采用PCR及測序對cheA突變株進行鑒定。采用rCheA-

5、IgG和rCheY-IgG錨定靶蛋白及蛋白磷酸化檢測試劑盒,測定cheA變株與野生株CheA和CheY分子磷酸化水平。采用幽門螺桿菌趨化模型及BALB/c小鼠感染模型,比較cheA突變株與野生株體外趨化及體內定植能力的差異。
　　 結果：PCR及測序結果證實cheA突變株基因組中cheA基因被敲除。0.001～0.1 mol/L鹽酸作用10 min,野生株CheA和CheY磷酸化水平分別從59.6±11.5和55.5±10.2μ

6、mol迅速下降至10.8±2.6和5.5±1.2μmol(P＜0.05),cheA突變株CheY磷酸化水平均較低且無明顯變化(P＞0.05)。cheA突變株對鹽酸、硫酸和乙酸趨化聚集環(huán)直徑(10～20±2.0～3.0 mm)明顯小于野生株(16～24±2.0～3.0 mm)(P＜0.05)。野生株感染小鼠胃黏膜標本中幽門螺桿菌分離陽性率(90％)明顯高于cheA突變株(40％)(P＜0.05),熒光定量PCR結果也顯示野生株感染小鼠胃黏