幽門螺桿菌體外誘導(dǎo)左氧氟沙星、阿莫西林耐藥的初步研究.pdf

1、目的：⑴采用抗生素濃度遞增法對(duì)幽門螺桿菌(H.pylori)菌株進(jìn)行體外誘導(dǎo)耐藥,比較H.pylori對(duì)左氧氟沙星(LEV)、阿莫西林(AMX)獲得耐藥性的難易程度。⑵探討LEV、AMX藥物濃度對(duì)Hpylori耐藥菌株及耐藥突變位點(diǎn)的影響。⑶分析耐藥菌株與敏感菌株之間的DNA序列差異。
　　 方法：①采用抗生素濃度遞增法(2n×MIC)進(jìn)行ATCC43504的體外誘導(dǎo)耐藥,誘導(dǎo)成功后在非選擇性培養(yǎng)基上傳代兩次,用瓊脂稀釋法再次測(cè)

2、定誘導(dǎo)后的MIC值(終末MIC值)。在固定的誘導(dǎo)倍數(shù)(誘導(dǎo)MIC值/基礎(chǔ)MIC值)下,比較兩組的誘導(dǎo)耐藥成功率、誘導(dǎo)周期,以分析LEV、AMX獲得性耐藥的難易程度。②對(duì)2×MIC和4×MIC LEV濃度篩選出的耐藥突變菌株進(jìn)行喹諾酮耐藥決定區(qū)編碼促旋酶gyrA和gyrB基因的PCR和DNA測(cè)序,對(duì)2×MIC和4×MIC AMX濃度篩選出的耐藥突變菌株進(jìn)行編碼青霉素結(jié)合蛋白PBP1和PBP2基因的PCR和DNA測(cè)序。③DNA測(cè)序結(jié)果在Ge

3、nebank中進(jìn)行序列比對(duì)分析,以明確具體位點(diǎn)的突變。
　　 結(jié)果：⑴LEV和AMX分別以2×、4×、6×、8×MIC濃度經(jīng)過6～9代體外誘導(dǎo)后,4個(gè)濃度LEV組均誘導(dǎo)出耐藥菌株,而AMX2×、4×、6×MIC組可誘導(dǎo)出耐藥菌株,而8×MIC組誘導(dǎo)后的MIC值未能達(dá)到耐藥標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)兩種抗生素的誘導(dǎo)周期進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn):LEV誘導(dǎo)初期,MIC值增長(zhǎng)較快,但后期停滯,尤其當(dāng)MIC值達(dá)到4ug/ml以后難以繼續(xù)增長(zhǎng)；AMX誘導(dǎo)過程中,MIC

4、值初期增長(zhǎng)較快,但當(dāng)MIC值增長(zhǎng)至1.0ug/ml時(shí)非但沒繼續(xù)增長(zhǎng)甚至有回落現(xiàn)象。⑵左氧氟沙星及阿莫西林在低濃度(2×MIC)選擇出的耐藥菌株均未檢測(cè)出有靶位基因的改變,高濃度(4×MIC)左氧氟沙星選擇出的耐藥菌株gyrA突變位點(diǎn)有:Asp87→His,Gly81→Asp,Asp678→Glu,Leu536→Pro,Tyr628→leu,Arg752→Arg；gyrB突變位點(diǎn)有Lys447→Glu,Tyr628→Leu；高濃度(4×M

5、IC)阿莫西林選擇出的耐藥菌株的位點(diǎn)改變?nèi)缦聀bp1:Gly320→Val,Phe423→Leu,Ala79→His,Thr541→Leu,Asn593→Thr,pbp2:Asn296→Ala,His494→Ser,Ser541→Val。
　　 結(jié)論：①根據(jù)結(jié)果分析:H.pylori對(duì)LEV和AMX可發(fā)生獲得性耐藥,對(duì)比兩種抗生素,LEV比AMX更易發(fā)生獲得性耐藥。②不同濃度LEV、AMX對(duì)H.pylori耐藥菌株耐藥突變位點(diǎn)有