人參皂苷-α-鼠李糖苷酶的分離純化及真菌RNA提取的研究.pdf

1、本文主要研究微生物sp.G3g菌產(chǎn)人參皂苷-α-鼠李糖苷酶的分離純化和真菌中RNA的提取.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:sp.G3g菌產(chǎn)人參皂苷-α-鼠李糖苷酶的最佳誘導(dǎo)物為人參,最佳濃度為4％;最佳發(fā)酵時(shí)間為120小時(shí);用硫酸銨沉淀人參皂苷-α-鼠李糖苷酶的最佳硫酸銨飽和度為85％.選用0.025M pH7.2 Tris-Hcl緩沖體系下的DEAE-Cellulose DE52分離提純?nèi)藚⒃碥?α-鼠李糖苷酶,SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定結(jié)果為單-

2、的單點(diǎn),酶蛋白分子量約為56kDa.人參皂苷-α-鼠李糖苷酶在提純過(guò)程中的收率為2.9％;比活力由發(fā)酵粗酶液的14.1 U/mg上升為65.6U/mg,提高了4.6倍.對(duì)sp.G3g菌所產(chǎn)人參皂苷-α-鼠李糖苷酶做蛋白質(zhì)電印跡以及蛋白質(zhì)N-端序列測(cè)定,N-端1 6個(gè)氨基酸殘基依次為Ser-Thr-Pro-Ala-Asp-Asn-Val-Ser-Gln-Ser-Ile-Tyr-Asn-Gln-Asn-Thr,測(cè)序結(jié)果提取的酶蛋白純度在97

3、％以上.以這16個(gè)氨基酸殘基為基礎(chǔ),在國(guó)際互聯(lián)網(wǎng)蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)中作蛋白質(zhì)同源性比較,發(fā)現(xiàn)與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中已知的蛋白質(zhì)沒(méi)有同源性.sp.G3g菌所產(chǎn)人參皂苷-α-鼠李糖苷酶的最適反應(yīng)條件的研究表明:酶反應(yīng)的最佳底物濃度為1.0mg/ml,最佳酶反應(yīng)時(shí)間為18小時(shí),最適溫度為40℃,最適pH值為5.0.對(duì)人參皂苷-α-鼠李糖苷酶的底物水解能力進(jìn)行的研究表明:提純酶只水解人參皂苷-α-鼠李糖苷鍵,酶活力為46.5 U/ml,對(duì)pNPR和蘆丁

4、的酶反應(yīng)活性都很低,分別為1.0U/ml和0.8 U/ml.說(shuō)明人參皂苷-α-鼠李糖苷酶具有水解人參皂苷Re的C-6位末端上的α-鼠李糖苷鍵的酶專(zhuān)一性,是專(zhuān)一性酶.本文采用異硫氰酸胍和Catrimox-14TM聯(lián)合變性,酚、氯仿、異戊醇多次抽提,用異丙醇沉淀RNA,得到了高質(zhì)量、完整的RNA.提取的RNA OD<,260>/OD<,230>=2.16,OD<,260>/OD<,280>=1.82,純度較好,無(wú)雜質(zhì)污染,均一性比較好.在1