人APE1單克隆抗體的制備及其在腫瘤血清學(xué)檢測中的應(yīng)用研究.pdf

1、腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)和診斷對腫瘤的預(yù)防和治療至關(guān)重要。腫瘤標(biāo)志物作為腫瘤臨床診斷的常規(guī)手段之一，對腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)和療效觀察具有重要意義。隨著ELISA、RT-PCR、FISH、SELDI-TOF、蛋白質(zhì)組學(xué)、組織芯片和基因芯片等生物技術(shù)的飛速發(fā)展，使得許多具有應(yīng)用前景的腫瘤標(biāo)志物逐一被發(fā)現(xiàn)，但目前仍無任何一種腫瘤標(biāo)志物可對惡性腫瘤進行準(zhǔn)確診斷和預(yù)后預(yù)測，腫瘤的實驗室診斷尚缺乏高敏感性和高特異性的檢測方法。研究表明，現(xiàn)有腫瘤標(biāo)志物存在特異性和陽

2、性率低的缺點，不能很好達到腫瘤“早期診斷”這一目的。對腫瘤標(biāo)志物進行聯(lián)合檢測能提高惡性腫瘤診斷的靈敏度及特異度，但仍存在診斷總準(zhǔn)確率不高的缺陷。因此，尋找一種新的高敏感、高特異性的腫瘤標(biāo)志物或建立一種新的腫瘤標(biāo)志物的聯(lián)合檢測方法成為大多數(shù)實驗室研究的方向之一。 人脫嘌呤脫嘧啶核酸內(nèi)切酶(Human apurinic/apyrimidiIuc endonuclease/redoxeffector factor，hAPE1)是DNA

3、損傷堿基切除修復(fù)(base excision repair，BER)途徑的關(guān)鍵酶，是一種多功能蛋白質(zhì)，具有修復(fù)AP位點和氧化還原雙重功能，與細胞凋亡，腫瘤細胞的增殖、分化和轉(zhuǎn)化，放化療敏感性以及神經(jīng)系統(tǒng)退行性變化有著密切的關(guān)系。國內(nèi)外研究表明，hAPE1蛋白在機體各器官組織中均有表達，而腫瘤組織中的hAPE1定位和表達與相應(yīng)的正常組織有顯著差異，其表達水平與腫瘤放化療抵抗有關(guān)。本課題前期研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤患者血清中hAPE1蛋白表達顯著高于

4、正常人。因此，hAPE1的表達水平(和/或類型)可作為篩選某些腫瘤的輔助手段，hAPE1有望成為腫瘤早期診斷中一項敏感而特異的指標(biāo)。我們推測，對hAPEI進行血清學(xué)檢測可能有助于惡性腫瘤的早期臨床診斷，并有效判斷腫瘤細胞放療和化療的敏感性。 研究目的： 1.構(gòu)建hAPE1原核表達載體，誘導(dǎo)表達、純化hAPE1融合蛋白，并對其生物學(xué)功能進行初步分析； 2.建立穩(wěn)定分泌hAPE1單克隆抗體的雜交瘤細胞株，制備并純化h

5、APE1單克隆抗體，鑒定其生物學(xué)特性并進行初步應(yīng)用； 3.初步應(yīng)用hAPE1血清學(xué)檢測方法探討hAPE1對惡性腫瘤的診斷作用，并與多腫瘤標(biāo)志物蛋白芯片檢測方法比較，探討hAPEl和多腫瘤標(biāo)志物蛋白芯片聯(lián)合檢測在惡性腫瘤診斷中的臨床意義。 研究內(nèi)容和方法： 1. hAPE1原核表達載體的構(gòu)建、融合蛋白的純化及功能鑒定 通過分子克隆技術(shù)構(gòu)建包含hAPE1全長基因序列的pET28a-hAPE1原核表達載體，經(jīng)測

6、序驗證后，將pET28a-hAPE1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入E.coli BL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)表達并鑒定，以His親和層析技術(shù)純化蛋白，用Western blot及EMSA實驗分析hAPEl融合蛋白的生物學(xué)功能。 2. hAPE1單克隆抗體的制備、生物學(xué)特性鑒定及初步應(yīng)用 以純化的hAPE1融合蛋白為抗原四肢皮下和腹腔注射免疫Balb/c小鼠，應(yīng)用細胞融合、間接ELISA法篩選和克隆化技術(shù)獲得穩(wěn)定分泌hAPEl單克隆抗

7、體的雜交瘤細胞株。以小鼠體內(nèi)誘生法產(chǎn)生腹水，鑒定單抗亞類后采用Protein G柱對其純化。采用秋水仙素阻抑實驗鑒定單抗的染色體核型，Westem blot和間接ELISA法鑒定單抗特異性、種屬交叉反應(yīng)、效價和親和力，hAPEl15肽陣列鑒定單抗的抗原表位。將單抗初步應(yīng)用于免疫印跡、免疫細胞化學(xué)、免疫細胞熒光和免疫組織化學(xué)試驗等實驗中評價單抗性能。 3.hAPE1雙抗夾心ELISA法在腫瘤血清學(xué)檢測中的初步應(yīng)用 對健康體

8、檢者、良性病變患者、腎癌、前列腺癌和睪丸癌患者的C-12多腫瘤標(biāo)志物蛋白芯片檢測結(jié)果進行回顧性分析，評價蛋白芯片的診斷作用；同時用hAPE1雙抗夾心ELISA法對同批樣本的血清標(biāo)本進行檢測，統(tǒng)計分析hAPEl的血清含量和診斷評價，并對兩種檢測結(jié)果進行比較，評價hAPEl在惡性腫瘤診斷中的意義。 研究結(jié)果： 1. hAPE1原核表達載體的構(gòu)建、融合蛋白的純化及功能鑒定 所構(gòu)建的pET28-hAPE1重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切

9、及DNA測序鑒定表明構(gòu)建正確。pET28-hAPE1重組質(zhì)粒在37℃，0.4mmol/L IPTG的誘導(dǎo)條件下可在E.coli BL21(DE3)中高效表達，蛋白含量可達菌體總蛋白量的50％，經(jīng)SDS-PAGE及Western blot鑒定均在預(yù)期位置出現(xiàn)陽性條帶；通過His親和層析純化得到純度90％以上的hAPE1融合蛋白，經(jīng)SDS-PAGE、Western blot及EMSA鑒定hAPEl融合蛋白具有抗原性、AP位點修復(fù)活性和氧化還

10、原活性。 2. hAPE1單克隆抗體的制備、生物學(xué)特性鑒定及初步應(yīng)用 經(jīng)過4次細胞融合，成功獲得了2株能穩(wěn)定分泌hAPE1單克隆抗體的雜交瘤細胞株，命名為雜交瘤細胞2-G1和4-F6，并通過抗體純化技術(shù)對大量制備的腹水進行濃縮和純化，得到純度90％以上的2-G1 mAb和4-F6 mAb。利用ELISA、Westernblot等方法檢測其效價超過1：107，Ig亞類分別是IgG2b和IgG3，親和常數(shù)分別為1.8×10-

11、7和3.4×10-5，能特異性識別hAPE1天然蛋白和融合蛋白，與兔、小鼠、大鼠無種屬交叉反應(yīng)。2-G1 mAb的抗原表位為構(gòu)象型表位，可應(yīng)用于免疫細胞化學(xué)、免疫細胞熒光和免疫組織化學(xué)等實驗技術(shù)中。 3. hAPE1雙抗夾心ELISA法在腫瘤血清學(xué)檢測中的初步應(yīng)用 健康體檢者、良性病變患者、腎癌、前列腺癌和睪丸癌患者血清中hAPE1含量分別為8.97(2.47，13.58) ng/ml、9.54(2,36，14.22)

12、ng/ml、14.98(7.14，45.33) ng/ml、14.29(10.83，33.68) ng/ml和20.74(8.76，58.81) ng/ml，腫瘤患者與健康體檢者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。hAPE1雙抗夾心ELISA法對腎癌、前列腺癌和睪丸癌的診斷陽性率分別為：57.14％、53.33％和66.67％，C-12多腫瘤標(biāo)志物蛋白芯片對腎癌、前列腺癌和睪丸癌的診斷陽性率分別為：48.65％、80,00％和62.1

13、6％。結(jié)果表明，兩種方法對3種腫瘤的診斷陽性率無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。除前列腺癌外，hAPE1與蛋白芯片聯(lián)合檢測腎癌和睪丸癌可顯著提高診斷陽性率，具有統(tǒng)計學(xué)差異( P<0.05)。 結(jié)論： 1.成功構(gòu)建hAPEl原核表達載體pET28a-hAPE1，可在E.coli BL21(DE3)中高效表達，經(jīng)His親和層析純化得到hAPEl融合蛋白，純度達90％以上，具有抗原性、AP位點修復(fù)活性及氧化還原活性。 2.

14、成功獲得2株穩(wěn)定分泌抗hAPEl單克隆抗體的雜交瘤細胞株2-G1和4-F6，并純化獲得2株高純度、高效價、高特異性和較高親和力的hAPEl單克隆抗體2-G1 mAb和4-F6 mAb。其中2-G1 mAb的抗原表位為構(gòu)象型表位，可用于多種免疫學(xué)實驗中，是良好的檢測試劑。 3.腎癌、前列腺癌和睪丸癌的血清hAPEl蛋白水平顯著高于健康體檢者，hAPE1雙抗夾心ELISA法在惡性腫瘤診斷中具有臨床意義，與C-12多腫瘤標(biāo)志物蛋白芯片