大黃素過渡金屬配合物的合成及抗腫瘤活性研究.pdf

1、中國傳統(tǒng)中藥中的藥用植物提供了很多具有藥理活性的化合物,對這些活性成分進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾是發(fā)現(xiàn)新型藥物的重要研究方向。大黃素(Emodin)為蒽醌衍生物,是蓼科植物虎杖、大黃根及根莖中的主要活性成分,具有抗菌、抗炎、抗病毒和保肝利尿等多種藥理活性。Emodin對多種腫瘤細(xì)胞具有抗增殖能力,但抗腫瘤活性較低。由此,以Emodin為先導(dǎo)化合物,對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾以改善其抗腫瘤活性的研究具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。本論文基于天然化合物金屬配合物中配體結(jié)構(gòu)

2、效應(yīng)以及金屬元素電子效應(yīng)對配合物藥理活性的協(xié)同作用,以Emodin為配體,合成其+2價(jià)過渡金屬配合物,通過波譜手段對配合物分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征,并利用生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)方法研究Emodin金屬配合物的抗腫瘤活性,采用分子生物學(xué)方法初步探討配合物對腫瘤細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)機(jī)制。主要研究內(nèi)容包括：
　?、乓訣modin為配體,合成了Cu(II)、Co(II)、Ni(II)、Zn(II)和Mn(II)金屬配合物,應(yīng)用元素分析法、熱重分析法、紅外

3、光譜法、紫外–可見分光光度法、質(zhì)譜法以及1H–NMR和13C–NMR對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。結(jié)果表明,Emodin通過1位羥基O和9位羰基O與金屬離子配位形成穩(wěn)定的六元環(huán)結(jié)構(gòu),且配合物分子中Emodin與金屬離子的化學(xué)計(jì)量比為2:1,同時(shí)含有兩個(gè)結(jié)晶水分子,分子式為M(II)(Emodin)2[M=Cu,Co,Ni,Zn,Mn]。
　?、撇捎米贤猕C可見分光光度法研究Emodin金屬配合物對活性自由基DPPH, OH·和O2-·的清除能力

4、。結(jié)果顯示,Emodin及其金屬配合物對三種活性自由基的清除能力隨濃度增加而增大,配合物的IC50值范圍在18.85μmol/L–34.98μmol/L之間,抗氧化能力優(yōu)于(Emodin)2和抗壞血酸(Vc),說明金屬元素的參與,提高了抗氧化能力,而金屬元素的種類對配合物的抗氧化能力存在影響。Emodin金屬配合物具有優(yōu)異的抗氧化活性,可預(yù)防或治療與氧化應(yīng)激有關(guān)的疾病,如癌癥。
　?、鞘褂米贤猕C可見分光光度法、熒光分光光度法以及粘

5、度法研究了Emodin及其金屬配合物與 DNA的相互作用方式。結(jié)果表明,Emodin金屬配合物主要以插入方式與DNA結(jié)合,根據(jù)結(jié)合常數(shù)Kb值以及淬滅常數(shù)Kq值,Emodin金屬配合物與DNA的結(jié)合能力較Emodin強(qiáng),順序?yàn)閆n(II)(Emodin)2>Ni(II)(Emodin)2>Cu(II)(Emodin)2>Co(II)(Emodin)2>Mn(II)(Emodin)2>(Emodin)2。與金屬元素配位后,共軛平面結(jié)構(gòu)增加,

6、使Emodin金屬配合物更容易插入到DNA的堿基對之間。此外,金屬元素對平面結(jié)構(gòu)有影響,因此,金屬配合物與DNA的結(jié)合能力存在差異。
　　(4)使用MTT法、顯微鏡觀測法、流式細(xì)胞術(shù)和分子生物學(xué)方法研究了Emodin過渡金屬配合物的抗腫瘤活性及作用機(jī)制。結(jié)果表明：五種Emodin過渡金屬配合物對五種腫瘤細(xì)胞(肝癌Hep G2,宮頸癌HeLa,乳腺癌MCF–7和MDA–MB–231以及黑色素瘤F10–B16)均有明顯的抗增殖作用,呈

7、濃度依賴性及時(shí)間依賴性。配合物的半數(shù)抑制濃度IC50值與(Emodin)2、Cisplatin的相比,降低了2–3倍,配合物的腫瘤細(xì)胞生長抑制活性強(qiáng)于Emodin與Cisplatin。其中, Hep G2、HeLa和MCF–7細(xì)胞對配合物較敏感。五種金屬配合物抗增殖活性順序與其DNA結(jié)合能力一致,說明配合物主要通過影響DNA生命活動而產(chǎn)生抗腫瘤活性；顯微鏡觀察 Emodin金屬配合物對腫瘤細(xì)胞形態(tài)的影響。結(jié)果顯示,隨著配合物作用濃度的增

8、加,腫瘤細(xì)胞貼壁性變差,懸浮細(xì)胞數(shù)量增多,細(xì)胞發(fā)生皺縮、體積變小的現(xiàn)象,細(xì)胞膜出現(xiàn)多個(gè)突起,有凋亡小體出現(xiàn),腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生凋亡現(xiàn)象；采用流式細(xì)胞術(shù)分析Emodin金屬配合物對腫瘤細(xì)胞生長周期以及早期凋亡細(xì)胞的影響。結(jié)果表明,隨著作用濃度的增加,Emodin金屬配合物使腫瘤細(xì)胞生長周期停滯于G1期,無法向S期和G2期移行,延長生長周期,降低增殖能力。而且,還使處于S期細(xì)胞數(shù)減少,降低了DNA復(fù)制能力,使腫瘤細(xì)胞的繁殖速度降低,抑制腫瘤細(xì)胞生

9、長。此外,隨配合物作用濃度增加而增多的早期凋亡細(xì)胞數(shù)則說明Emodin金屬配合物對腫瘤細(xì)胞具有誘導(dǎo)凋亡作用；應(yīng)用Real–Time PCR(RT–PCR)技術(shù),研究Emodin金屬配合物對Hep G2和MCF–7腫瘤細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白(p53,p21,caspase–3,bcl–2和bax蛋白)表達(dá)量的影響,以分析Emodin金屬配合物對腫瘤細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡機(jī)制。結(jié)果顯示,隨著配合物作用濃度的增加,腫瘤細(xì)胞中的p53蛋白被激活,隨之使下游

10、 p21和bax蛋白表達(dá)量增加,使細(xì)胞周期延長,并產(chǎn)生細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。此外,p53蛋白所導(dǎo)致的bcl–2蛋白表達(dá)量降低,使腫瘤細(xì)胞的抗凋亡能力減弱,bax/bcl-2值隨作用濃度增加而增大,使腫瘤細(xì)胞凋亡。此外,bax蛋白的高表達(dá)以及bcl–2蛋白的低表達(dá),激活了線粒體凋亡途徑,活化caspase–3蛋白,最終誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。在Hep G2細(xì)胞中,凋亡基因p53,p21,caspase–3和bax蛋白的表達(dá)量較MCF–7細(xì)胞中多,而抗凋

11、亡基因bcl–2的表達(dá)量則較MCF–7細(xì)胞少,說明了Emodin金屬配合物對Hep G2細(xì)胞較敏感,凋亡作用較強(qiáng),與抗增殖活性研究中的IC50值結(jié)果一致。
　　⑸本研究以具有抗腫瘤活性的Emodin作為先導(dǎo)化合物,合成了一系列+2價(jià)過渡金屬配合物,并對Emodin金屬配合物的抗氧化活性、與DNA結(jié)合方式、抗腫瘤活性進(jìn)行研究,并初步探討了其抗腫瘤機(jī)制,獲得了具有優(yōu)異抗腫瘤活性的金屬配合物,為開發(fā)高效無機(jī)化療藥物的設(shè)計(jì)和合成提供了非常