桔梗皂苷D及金屬（釕、銥）配合物的抗腫瘤活性研究.pdf

1、目的：在腫瘤的治療方面，化學(xué)療法、手術(shù)治療和放射療法依然是常用的治療手段。為了達(dá)到更好的治療效果，近年來(lái)一些中藥中的有效成分在抗腫瘤作用也受到了眾多青睞。中藥桔梗皂苷中的主要有效成分桔梗皂苷D除了鎮(zhèn)咳祛痰、抗炎、抗氧化等藥理活性外，對(duì)多種腫瘤細(xì)胞也具有抗腫瘤活性。然而，對(duì)其抗腫瘤研究范圍仍不全面，并且作用機(jī)制也不明確。因此，還有許多問(wèn)題需要解決。另外，就化學(xué)藥物而言，研究者早已認(rèn)為釕、銥金屬配合物具有較好的抗腫瘤潛力。然而，并沒(méi)有對(duì)配合

2、物的抗腫瘤活性及其信號(hào)通路作出確切的定論。釕、銥金屬配合物的抗腫瘤機(jī)制仍需要深入探究。
　　方法：采用MTT法對(duì)桔梗皂苷D和釕、銥金屬配合物的體外抗腫瘤活性進(jìn)行篩選；利用細(xì)胞內(nèi)吞、AO/EB染色法和流式細(xì)胞術(shù)對(duì)藥物能否誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡進(jìn)行了定性定量分析；采用DCFH-DA、JC-1染色，借助熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀分別對(duì)藥物作用后細(xì)胞內(nèi)活性氧水平、線粒體膜電位變化進(jìn)行定性定量檢測(cè)；單細(xì)胞凝膠電泳檢測(cè)了藥物是否損傷了細(xì)胞DNA；AO染色法

3、檢測(cè)桔梗皂苷D是否引起細(xì)胞發(fā)生自噬；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期是否在藥物作用后受到阻滯；利用Transwell小室檢測(cè)藥物是否影響了細(xì)胞侵襲能力；Western blot免疫印跡法從分子水平來(lái)分析藥物對(duì)細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響。
　　結(jié)果：
　　(1) MTT實(shí)驗(yàn)表明，桔梗皂苷D及合成的釕、銥金屬配合物各自的抗腫瘤活性不同，對(duì)某種特定的腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗腫瘤活性。
　　(2) AO/EB染色法觀察到了藥物作用后

4、腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)出的凋亡形態(tài)特征；流式細(xì)胞術(shù)定量檢測(cè)了細(xì)胞凋亡水平，進(jìn)一步確認(rèn)了藥物誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生了凋亡；同時(shí)也檢測(cè)出了細(xì)胞周期主要被阻滯在了G0/G1或G2/M期。
　　(3)用DCFH-DA、JC-1分別檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧水平和線粒體膜電位變化，在熒光顯微鏡下觀察到藥物作用后細(xì)胞內(nèi)發(fā)出了明亮的綠色熒光，細(xì)胞內(nèi)活性氧水平增加，線粒體膜電位下降；同時(shí)用流式細(xì)胞儀定量檢測(cè)了細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度，結(jié)果與顯微鏡下觀察的結(jié)果一致。
　　(4)單細(xì)

5、胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)說(shuō)明了桔梗皂苷D損傷了PC-12細(xì)胞的DNA，引起了DNA片段化。AO染色檢測(cè)細(xì)胞自噬表明桔梗皂苷D誘導(dǎo)PC-12細(xì)胞發(fā)生了自噬。
　　(5) Transwell小室檢測(cè)表明細(xì)胞侵襲能力受到了桔梗皂苷D及釕、銥金屬配合物較好地抑制。
　　(6) Western blot免疫印跡結(jié)果說(shuō)明藥物作用后細(xì)胞內(nèi)Caspase3、Bid和Bak蛋白表達(dá)出現(xiàn)了上調(diào)，同時(shí)Procaspase7、Bcl-2和Bcl-x蛋白表達(dá)出