志賀菌屬細(xì)菌耐藥相關(guān)質(zhì)粒的耐藥性研究.pdf

1、細(xì)菌耐藥,是指細(xì)菌能在殺死它們或削弱它們的藥物中獲得生存的本能。細(xì)菌耐藥性的來(lái)源有兩個(gè)途徑。即自身基因突變和耐藥基因的獲得。外源性耐藥基因的獲取,是細(xì)菌耐藥性廣泛散播的主要原因,一般通過(guò)可移動(dòng)遺傳元件完成,如質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、整合子、插入序列共同區(qū)(ISCR)等。質(zhì)粒是一種獨(dú)立的、可自我復(fù)制的遺傳元件,自身可攜帶耐藥基因,亦可作為其他可移動(dòng)遺傳元件的載體,介導(dǎo)菌株間基因水平轉(zhuǎn)移,在耐藥基因的擴(kuò)散過(guò)程中扮演著關(guān)鍵角色。因此研究質(zhì)粒DNA的結(jié)構(gòu)

2、,分析質(zhì)粒所攜帶的功能基因及質(zhì)粒與細(xì)菌耐藥性的關(guān)系,對(duì)細(xì)菌耐藥分子機(jī)制的深入研究具有重要意義。為了系統(tǒng)研究基因的水平轉(zhuǎn)移,本課題組已選用對(duì)抗生素敏感的一株福氏志賀菌Z23作為受體菌,以臨床分離的耐多藥大腸桿茼E667為供體菌,通過(guò)接合轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了多重耐藥轉(zhuǎn)移菌株ZT,并通過(guò)抑制性消減雜交實(shí)驗(yàn)篩選出一部分序列,斑點(diǎn)雜交試驗(yàn)結(jié)果表明這些序列在供體菌及轉(zhuǎn)移菌株的質(zhì)粒上均存在,克隆轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)這些序列與細(xì)菌耐藥有關(guān)(故之后稱(chēng)這些序列為耐藥相關(guān)

3、序列)。但是含有這些耐藥相關(guān)序列的質(zhì)粒是否為耐藥質(zhì)粒,是否為接合質(zhì)粒,介導(dǎo)供體菌和受體菌之間耐藥性的傳遞,仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。
　　 目的：通過(guò)轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)獲得含有該質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子,分析該質(zhì)粒與耐藥性的關(guān)系,對(duì)該質(zhì)粒上的耐藥基因進(jìn)行篩選,檢測(cè)該質(zhì)粒上所存在的與耐藥相關(guān)的可移動(dòng)遺傳元件,以探索該質(zhì)粒在耐藥過(guò)程中所起的作用及其耐藥機(jī)制,為更全面的了解質(zhì)粒所介導(dǎo)的耐藥分予機(jī)制提供基礎(chǔ)資料。
　　 方法：⑴陽(yáng)性克隆的獲得：通過(guò)改進(jìn)分子克隆

4、上面的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)方法,降低預(yù)培養(yǎng)轉(zhuǎn)速、預(yù)培養(yǎng)溫度及延長(zhǎng)預(yù)培養(yǎng)時(shí)間,將實(shí)驗(yàn)室儲(chǔ)存的志賀菌屬細(xì)菌質(zhì)粒(該質(zhì)粒來(lái)源于通過(guò)接合轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)獲得的耐多藥的志賀菌屬轉(zhuǎn)移株ZT,供體菌為臨床分離的耐多藥的大腸桿菌E667,受體菌為敏感的福氏志賀菌Z23)轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌DH-5α中,分別涂布在含單一抗生素的培養(yǎng)基上,抗生素包括頭孢噻吩(CF)、磺胺甲嗯唑(SMZ)、諾氟沙星(NOR)、慶大霉素(GM),濃度分別為最小抑菌濃度(MIC)、1/2最小抑菌

5、濃度(1/2MIC),過(guò)夜培養(yǎng)18h-24h后,挑取板上的單克隆,進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增耐藥相關(guān)序列T2G6(本課題組前期研究篩選的位于質(zhì)粒上的耐藥相關(guān)序列之一),以篩選陽(yáng)性克隆。⑵質(zhì)粒提取：將陽(yáng)性克隆挑至含NOR的LB液體培養(yǎng)基中,過(guò)夜培養(yǎng),通過(guò)離心收集菌體,進(jìn)而使用Axygen生物公司的質(zhì)粒小量提取試劑盒提取質(zhì)粒,然后在0.5％的瓊脂糖凝膠上與原質(zhì)粒進(jìn)行電泳比對(duì)。⑶藥物敏感試驗(yàn)：以紙片法抗菌藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)及美國(guó)國(guó)立臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(N

6、CCLS)指南為參照,采用Kin-Bauer紙片瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏鑒定,抗生素藥敏紙片包括:頭孢噻吩(CF)、頭孢唑啉(CFZ)、頭孢呋辛鈉(CXM)、頭孢他啶(CAZ)、頭孢他啶/克拉維酸(CAZL)、頭孢吡肟(FEP)、頭孢噻肟(CTX)、頭孢噻肟/克拉維酸(CTXL)、頭孢唑肟(ZOX)、頭孢哌酮(CFP)、氨曲南(AZT)、磺胺甲惡唑(SMZ)、甲氧芐啶(TMP)、諾氟沙星(NOR)、阿莫西林(AMX)、氨芐兩林(AMP)、氯霉

7、素(CHL)、四環(huán)素(TET)、鏈霉素(STR)、慶大霉素(GM)、亞胺培南(IPM)等。所用質(zhì){空菌株為大腸桿菌ATCC25922。⑷耐藥基因篩選：根據(jù)藥敏結(jié)果參考相關(guān)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)引物篩選質(zhì)粒上可能存在的耐藥相關(guān)基因:喹諾酮類(lèi)耐藥相關(guān)基因qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、qnrS、qepA、aac(6')-Ib-cr,頭孢菌素類(lèi)耐藥相關(guān)基因blaTEM、blaSHV、blaCTX、Ampe,磺胺耐藥基因sul1及氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因

8、cat等的引物,PCR相關(guān)基因,并將獲得的PCR產(chǎn)物送至生物公司測(cè)序鑒定,經(jīng)BLAST比對(duì)后對(duì)基因進(jìn)行確認(rèn)。⑸耐藥相關(guān)的可移動(dòng)遺傳元件的篩選：參考相關(guān)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)引物篩選質(zhì)粒上可能存在的可移動(dòng)遺傳元件相關(guān)基因,包括插入序列ISEcpl、IS26、IS903、ISCR1;整合酶基囚intI1、intI2及intI3:接合質(zhì)粒遺傳標(biāo)記traA、trbC。PCR相關(guān)基因,并將獲得的PCR產(chǎn)物送至生物公司測(cè)序鑒定,經(jīng)BLAST比對(duì)后對(duì)基因進(jìn)行確認(rèn)。

9、
　　 結(jié)果：①質(zhì)粒鑒定：通過(guò)對(duì)抗生素培養(yǎng)板上的單克隆進(jìn)行茵落PCR耐藥相關(guān)序列T2G6,在含NOR(1/2MIC)的LB固體培養(yǎng)基上獲得陽(yáng)性克隆;質(zhì)粒凝膠電泳比對(duì)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒即為所轉(zhuǎn)化的志賀菌屬細(xì)菌質(zhì)粒。②藥敏鑒定：感受態(tài)大腸桿菌對(duì)所有的抗生素敏感,轉(zhuǎn)化子對(duì)CAZ、AZT耐藥,對(duì)CTX、ZOX中介耐藥,對(duì)其他抗生素則敏感。轉(zhuǎn)化子與感受態(tài)大腸桿菌相比:CTX、CFP、ZOX、FEP、NOR、CIP、LVF、SMZ、TMP、

10、CHL的抑菌環(huán)直徑減小5mm以上:CFZ、CXM、AMP、AMX、GM、STR、TET、IPM抑菌環(huán)直徑的變化在5mm內(nèi)。ESBLs確證實(shí)驗(yàn)表明該轉(zhuǎn)化子為非產(chǎn)ESBLs菌株。③耐藥基因的篩選：該質(zhì)粒上存在耐藥基因TEM-116、sull及cat,未檢測(cè)到喹諾酮類(lèi)抗生素耐藥相關(guān)基因。④耐藥相關(guān)可移動(dòng)遺傳元件的篩選：1類(lèi)整合子酶基因檢測(cè)陽(yáng)性;接合質(zhì)粒遺傳標(biāo)記trbC篩選陽(yáng)性;未檢測(cè)到插入序列ISEcp1、IS26、IS903、ISCR1的存