細(xì)菌耐藥性檢測(cè)課件

1、細(xì)菌的耐藥性與耐藥細(xì)菌檢測(cè),細(xì)菌耐藥性,指細(xì)菌與抗生素多次接觸后，對(duì)抗生素的敏感性下降甚至消失，致使抗生素對(duì)耐藥菌的療效降低或無(wú)效。耐藥的程度以最小抑菌濃度（MIC）表示,細(xì)菌如何產(chǎn)生耐藥性？,細(xì)菌如何產(chǎn)生抗藥性？,,據(jù)國(guó)內(nèi)權(quán)威醫(yī)療機(jī)構(gòu)調(diào)查統(tǒng)計(jì)：我國(guó)每年約有２０萬(wàn)人死于藥品不良反應(yīng)，其中４０％（８萬(wàn)人）死于抗生素濫用?！翱股乇旧頍o(wú)辜，問(wèn)題在于人們?yōu)E用了它?！薄翱股厝缤话央p刃劍，合理使用當(dāng)然有益，使用不當(dāng)就會(huì)傷害自己?！?

2、細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的原因,服藥療程不足： 用藥不當(dāng)： 重復(fù)用藥： 劑量不足： 藥物交互作用：,服藥療程不足：很多病人以為癥狀已經(jīng)緩解就不需再服藥，令所幸存的細(xì)菌開(kāi)始產(chǎn)生耐藥性，留在病人體內(nèi)，甚至傳播到他人。用藥不當(dāng)：醫(yī)生在某些情況下會(huì)誤用抗生素, 又或者因應(yīng)病人要求而濫用抗生素, 不是細(xì)菌引起的疾病(例如多數(shù)傷風(fēng)由病毒引起)，卻使用抗生素治療，不但對(duì)癥狀毫無(wú)幫助，更促使細(xì)菌產(chǎn)生抗藥。重複用藥：要時(shí)抗生素的應(yīng)用廣泛，在醫(yī)學(xué)

3、，動(dòng)植物及農(nóng)業(yè)上都大量應(yīng)用抗生素.若重複使用某種抗生素，細(xì)菌會(huì)慢慢學(xué)習(xí)改造自己以產(chǎn)生抗藥性，就像適應(yīng)環(huán)境一樣，最後就不會(huì)被該種抗生素殺死。劑量不足：當(dāng)抗生素劑量不足，只能殺死部分細(xì)菌，存活下來(lái)的細(xì)菌，為求生存就利用基因轉(zhuǎn)變等方法改造自己，而不再被相同的抗生素消滅。藥物交互作用：有些藥物若與抗生素共同服用，會(huì)在身體內(nèi)產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)，而減低抗生素的效用，造成無(wú)法殺死細(xì)菌，存活的細(xì)菌因此產(chǎn)生抗藥性。,細(xì)菌耐藥性的分類,（一）固有耐藥性&#

4、160;   指天然耐藥性。是由細(xì)菌染色體決定的，具有穩(wěn)定的遺傳性，可代代相傳，故有絕對(duì)耐藥之說(shuō)，如革蘭氏陰性菌對(duì)早期青霉素天然耐藥，產(chǎn)氣桿菌對(duì)頭孢西丁天然耐藥等。,常見(jiàn)細(xì)菌的天然耐藥,（二）獲得耐藥性,由于細(xì)菌基因的突變、耐藥基因片段的轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移、噬菌體的轉(zhuǎn)導(dǎo)等原因，導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生耐藥。,基因突變,耐藥基因位于染色體上，隨細(xì)菌分裂傳至后代基因突變頻率105~109通常只對(duì)1，2種類似藥物產(chǎn)生耐藥,質(zhì)粒介導(dǎo)

5、的耐藥性,質(zhì)粒是位于染色體外的DNA R質(zhì)粒—耐藥質(zhì)粒 接合型 非接合型接合型：耐藥決定因子+耐藥接合因子非接合型：耐藥決定因子轉(zhuǎn)移方式：接合型：接合轉(zhuǎn)移 非接合型：轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)等方式,,,,基因傳播的方式,轉(zhuǎn)化：耐藥菌溶解后釋放的DNA進(jìn)入敏感菌體內(nèi)，其耐藥基因與敏感菌中的同種基因重新組合，使其變成耐藥菌。

6、轉(zhuǎn)導(dǎo)：耐藥菌以噬菌體為媒介將耐藥基因轉(zhuǎn)移給敏感菌的現(xiàn)象。轉(zhuǎn)座：耐藥基因可自一個(gè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)座到另一個(gè)質(zhì)粒，叢質(zhì)粒到染色體或從染色體到噬菌體等的現(xiàn)象。,細(xì)菌主要耐藥機(jī)制,一、水解酶或鈍化酶的產(chǎn)生二、靶位結(jié)構(gòu)改變?nèi)?、抗生素滲透屏障作用四、主動(dòng)外排功能增強(qiáng)（泵出機(jī)制）五、細(xì)菌菌膜形成,一、滅活酶或鈍化酶的產(chǎn)生,β-內(nèi)酰胺酶可以打開(kāi)β-內(nèi)酰胺類藥物分子結(jié)構(gòu)中的β-內(nèi)酰胺環(huán)，使其完全失去抗菌活性。 氨基糖苷類藥物鈍化酶、氯霉

7、素乙酰轉(zhuǎn)移酶、MLS（大環(huán)內(nèi)酯類、林可霉素、鏈陽(yáng)菌素類）抗菌藥物鈍化酶，可催化某些基團(tuán)結(jié)合到抗生素上，使之失活。,二、靶位結(jié)構(gòu)改變,藥物作用的靶位發(fā)生改變：使抗生素不易與之結(jié)合。     如利福平作用點(diǎn)是RNA聚合酶的β亞基，當(dāng)β亞基的編碼基因突變時(shí)，就產(chǎn)生了耐藥性。,主要抗菌藥物作用靶位,β-內(nèi)酰胺類-青霉素結(jié)合蛋白（PBP）氨基糖苷類-核糖體30S亞基大環(huán)內(nèi)酯類-核糖體50S亞基氟喹諾酮

8、類-DNA旋轉(zhuǎn)酶（拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ）、拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ糖肽類D-丙氨酰D-丙氨酸四環(huán)素類-核糖體50S亞基,三、抗生素滲透屏障作用,細(xì)菌可通過(guò)各種途徑使抗生素不易進(jìn)入菌體，如某些桿菌的細(xì)胞外膜對(duì)青霉素等有天然屏障作用；還有些細(xì)菌可通過(guò)細(xì)胞壁水孔或細(xì)胞外膜通道的改變，使抗生素不易滲透至細(xì)菌體內(nèi)，產(chǎn)生耐藥。,四、主動(dòng)外排功能增強(qiáng),有些抗菌藥物（常見(jiàn)的有四環(huán)素與喹諾酮類）能誘導(dǎo)細(xì)菌主動(dòng)外排，抗菌藥物難以在菌體內(nèi)積累到有效濃度，造成對(duì)抗菌藥物耐藥程

9、度普遍提高。,五、細(xì)菌菌膜形成,指細(xì)菌粘附在固體或有機(jī)腔道表面，形成為微菌落，并分泌多糖蛋白復(fù)合物將自身包裹其中而形成膜狀物，可阻止藥物作用于細(xì)菌。,4種主要耐藥機(jī)制,泵出,失活,滲透障礙,靶位改變,主要耐藥機(jī)制,? β- 內(nèi)酰胺酶,? 最主要的耐藥因素? 對(duì)β-內(nèi)酰胺抗生素造成威脅,β-內(nèi)酰胺酶的種類,A組β-內(nèi)酰胺酶 （青霉素酶） [ESBLs]絲氨酸β-內(nèi)

10、酰胺酶 D組β-內(nèi)酰胺酶 （苯唑西林酶） C組β-內(nèi)酰胺酶 （頭孢菌素酶）[AmpC]金屬β-內(nèi)酰胺酶 B組β-內(nèi)酰胺酶

11、（碳青霉烯酶）[IMP-1],,,重要的β－內(nèi)酰胺酶,廣譜酶：TEM-1,2， SHV-1超廣譜酶： ESBLs (TEM-3 to TEM-100;SHV-2 to SHV-36; CTX-M type ESBLs)高產(chǎn)C類頭孢菌素酶：AmpC,廣譜酶，導(dǎo)致大腸埃希菌和克雷伯菌對(duì)氨芐西林，頭孢唑林和哌拉西林耐藥,產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶菌株藥敏試驗(yàn)的特點(diǎn),可水解青霉素和半合成青霉素以及第一代、第二代頭孢菌素，多數(shù)可被酶制劑所抑制對(duì)第三代

12、、第四代頭孢菌素、碳青霉烯類以及酶抑制劑復(fù)方制劑均高度敏感。,超廣譜β－內(nèi)酰胺酶是質(zhì)粒介導(dǎo)的能夠水解頭孢他啶、頭孢噻肟等亞氨基β-內(nèi)酰胺類及氨曲南等單環(huán)酰胺類抗生素，并可被克拉維酸等β-內(nèi)酰胺酶抑制劑所抑制的一類β-內(nèi)酰胺酶。,產(chǎn)ESBLs菌株的藥敏試驗(yàn)特點(diǎn),ESBLs菌株：主要為大腸埃希氏和肺炎克雷伯菌?？伤飧鞣Nβ-內(nèi)酰胺類抗生素包括第三代的頭孢他定、頭孢噻肟、頭孢曲松和氨曲南等含氧亞氨基側(cè)鏈的頭孢菌素多數(shù)可被酶抑制劑所抑制對(duì)

13、碳青霉烯類高度敏感，對(duì)頭霉素類、頭孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/三唑巴坦等復(fù)方制劑多數(shù)呈敏感。,,ESBLs總陽(yáng)性率為40.3%，以重癥監(jiān)護(hù)病房為最高（75.0%）。產(chǎn)ESBLs菌對(duì)頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢曲松的耐藥性高達(dá)82.9%～100.0%，較不產(chǎn)ESBLs菌高77.0%～94.0%。對(duì)氨基糖苷類、氟喹諾酮類、磺胺類的交叉耐藥性最高分別達(dá)到96.3%、85.2%、92.6%，所有受試菌對(duì)亞胺培南均敏感。大腸埃希菌對(duì)阿米卡星耐藥率較肺炎

14、克雷伯菌低。,AmpC ß-內(nèi)酰胺酶,與ESBLs 在結(jié)構(gòu)上不同能水解第三代頭孢菌素可水解頭霉素類(如頭孢西丁、頭孢替坦、頭孢美唑),產(chǎn)AmpC酶菌株的藥敏試驗(yàn)特點(diǎn),產(chǎn)生菌：腸桿菌屬、普羅威登菌屬、摩根菌屬、弗勞地枸櫞酸桿菌、沙雷菌屬和綠膿桿菌對(duì)頭霉素類、第三代頭孢菌素和酶抑制劑復(fù)方制劑耐藥、同時(shí)對(duì)喹諾酮類和氨基糖苷類耐藥對(duì)第四代頭孢菌素頭孢吡肟和碳青霉烯類敏感如為ESBLs+AmpC酶株第四代頭孢菌素亦耐藥,碳青酶

15、烯水解酶,能夠水解亞胺培南或美羅培南等碳青霉烯類抗菌藥物的β-內(nèi)酰胺酶 有3類：A類獲得性碳青霉烯水解酶（2f群）OXA 23-27金屬酶,產(chǎn)碳青霉烯酶菌株的藥敏試驗(yàn)特點(diǎn),產(chǎn)生菌：銅綠假單胞菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、部分腸桿菌科細(xì)菌可水解各種廣譜β-內(nèi)酰胺類抗生素包括第三代、第四代頭孢菌素和酶抑制劑復(fù)方制劑，頭霉素類、碳青霉烯類等多為泛耐藥菌株，并同時(shí)對(duì)喹諾酮類和氨基糖苷類耐藥。,腸桿菌科細(xì)菌,大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、產(chǎn)酸克雷伯菌

16、和奇異變形桿菌中凡ESBLs產(chǎn)生菌株增加了對(duì)碳青霉烯酶的檢測(cè)的要求腸桿菌科細(xì)菌如產(chǎn)生碳青霉烯酶，即使體外敏感，也可能臨床使用碳青霉烯類治療時(shí)失敗。,KPC(肺克)碳青霉烯酶,可水解碳青霉烯類、青霉素類、頭孢菌素類和氨曲南等抗生素，能被克拉維酸抑制1966年首先在美國(guó)北卡羅來(lái)納的肺炎克雷伯菌中發(fā)現(xiàn)KPC-1、此后在世界各國(guó)相繼發(fā)現(xiàn)KPC-2-4，幷涉及沙門菌、產(chǎn)酸克雷伯菌、陰溝、產(chǎn)氣及其他腸桿菌科細(xì)菌,耐藥細(xì)菌及酶類的檢測(cè) β-內(nèi)

17、酰胺酶的檢測(cè) MRSA的檢測(cè) 耐青霉素肺炎球菌的檢測(cè) VISA與VRSA的檢測(cè) 如何檢測(cè)KPC酶,β-內(nèi)酰胺酶的檢測(cè),頭孢硝噻吩法原理：頭孢硝噻吩的β-內(nèi)酰胺環(huán)受β-內(nèi)酰胺酶的作用開(kāi)環(huán)后，產(chǎn)生由黃色向紅色轉(zhuǎn)變的顏色反應(yīng)，即為產(chǎn)酶菌株。方法：1.用滴管吸取頭孢硝噻吩液1滴直接置于測(cè)試菌的菌落上，觀察菌落及周圍培養(yǎng)基顏色變化，產(chǎn)生紅色者即為產(chǎn)酶陽(yáng)性。2.紙片法：用1 滴無(wú)菌水將頭孢硝噻吩紙片濕潤(rùn)，把測(cè)試菌直接涂于經(jīng)濕

18、潤(rùn)后的頭孢硝噻吩紙片，即可觀察其顏色反應(yīng)，產(chǎn)生紅色者為產(chǎn)酶陽(yáng)性。,頭孢硝噻吩法,測(cè)定菌：葡萄球菌、腸球菌、嗜血桿菌屬、淋病奈瑟菌屬、卡他莫拉菌屬產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶特點(diǎn)：簡(jiǎn)便、快速、靈敏，但價(jià)格相對(duì)較昂貴。,紙片法,,ESBL確證試驗(yàn),1.紙片擴(kuò)散法 將CAZ、CD02(頭孢他啶/克拉維酸)，CTX、CD03(頭孢噻肟/克拉維酸)兩組紙片對(duì)細(xì)菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，當(dāng)CD02或CD03任意復(fù)方制劑的抑菌圈直徑與相應(yīng)單藥抑菌圈直徑相差≥

19、5mm，即可判斷該菌產(chǎn)ESBL原理：因細(xì)菌產(chǎn)生的ESBL活性被CD02或CD03中的克拉維酸所抑制，CAZ或CTX可恢復(fù)抗菌活性,2.MIC測(cè)定,⑴.稀釋法菌液配置：肉湯稀釋法菌液稀釋濃度為105CFU/ml 瓊脂稀釋法菌液濃度104 CFU/ml,,,,,,,Etest試條模板的應(yīng)用,Etest 試條放置瓊脂表面時(shí)有MIC 刻度面須朝上，勿將試條倒置，一旦放下，切勿再移動(dòng)試條。放置時(shí)試條柄端（標(biāo)有字母E）應(yīng)盡可能靠近平皿邊

20、緣。如果不小心將試條刻度面朝下即MIC 刻度面與瓊脂貼合，則從柄端提起試條反轉(zhuǎn)過(guò)來(lái)再貼在瓊脂上，使刻度面朝上。,Etest試條模板的應(yīng)用,作苛養(yǎng)菌或極敏感菌株藥敏時(shí)，150mm 平皿上只能放置4 ~ 5 個(gè)試條，90mm平皿只放1個(gè)試條。將試條放置平板上的方法有用鑷子，Etest 加樣器或真空筆。如果試條放到非正常位置，勿移動(dòng)試條，維持原狀判讀結(jié)果。,,,4.MIC--自動(dòng)儀器 5.分子生物學(xué)試驗(yàn),MRSA的檢測(cè),

21、48633;紙片擴(kuò)散法􀀹MIC（自動(dòng)儀器）􀀹苯唑西林-鹽篩選平板􀀹基因：mecA􀀹基因產(chǎn)物：PBP2a,目前G＋球菌的主要耐藥問(wèn)題,葡萄球菌中最主要的問(wèn)題是MRSA，耐藥性高，致病力強(qiáng)，引起全身感染病死率可高達(dá)50％！MRSA應(yīng)報(bào)告對(duì)所有β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥，常表現(xiàn)出同時(shí)對(duì)如氨基糖甙類、喹諾酮類及大環(huán)內(nèi)酯類等多種抗菌藥物耐藥，糖肽類抗菌藥物（如萬(wàn)古霉素

22、）成為臨床治療的唯一選擇，在大量應(yīng)用的選擇壓力下必將出現(xiàn)對(duì)萬(wàn)古霉素耐藥的金黃色葡萄球菌，雖然迄今我國(guó)尚未發(fā)現(xiàn)，但在其他國(guó)家已有多例報(bào)道。,MRSA耐藥的機(jī)理,金黃色葡萄球菌有4種青霉素結(jié)合蛋白（PBP）PBP1， PBP2， PBP3， PBP4MRSA 的發(fā)生是因?yàn)楫a(chǎn)生了除上述4種PBP外變異的PBP2a，PBP2a與青霉素等ß-內(nèi)酰胺類抗菌藥物親和力低，不能有效結(jié)合,MRSA的檢測(cè),1. 4%NaCl-6ug/ml苯唑西

23、林鹽平板 培養(yǎng)條件：35℃，18~24h 結(jié)果：＞1個(gè)菌落生長(zhǎng)，判為甲氧西林耐藥菌株2. 苯唑西林紙片法：10ug/片 金葡菌：11-12mm 凝固酶陰性葡萄球菌：≤17mm3. 頭孢西丁紙片法：30ug/片 金黃色葡萄球菌： ≤21 凝固酶陰性葡萄球菌：≤24mm目前CLSI規(guī)定：用頭孢西丁代替苯唑西林進(jìn)行檢測(cè),VRE（耐萬(wàn)古霉素腸球菌）檢測(cè),萬(wàn)古霉素紙片擴(kuò)散法 含量：3

24、0ug/片 結(jié)果：透射光，抑菌圈內(nèi)出現(xiàn)薄霧狀或任何其他生長(zhǎng)或抑菌圈≤14mm均表示耐藥 抑菌圈15-16mm為中度敏感 抑菌圈≥17mm為敏感萬(wàn)古霉素耐藥確證試驗(yàn) 含6ug/ml萬(wàn)古霉素的M-H平板 0.5麥?zhǔn)蠁挝痪?35 ℃，24h ≥1個(gè)菌落即判定為耐藥分子生物學(xué)方法：VanA、VanB、VanC等基因,耐青霉素肺炎球菌的檢測(cè),苯唑西林：1ug/片抑菌圈直

25、徑≥20mm為青霉素敏感株抑菌圈直徑≤ 19mm為青霉素中敏或耐藥株，必須進(jìn)行青霉素MIC測(cè)定。 MIC ≤0.06 ug/ml S（pssp) 0.125-1 ug/ml I (pisp) ≥2 ug/ml R (prsp),如何檢測(cè)KPC酶,產(chǎn)KPC酶的菌株用常規(guī)藥敏試驗(yàn)不易檢出CLSI關(guān)于碳青霉稀類的判斷標(biāo)準(zhǔn)：MIC 厄他培南≤ 2ug/ml 亞胺培南、美羅

26、培南≤ 4ug/mlMIC 2ug/ml或4ug/ml的菌株仍可判斷為敏感注意：在常規(guī)藥敏試驗(yàn)中如遇第三、第四代頭孢菌素以及其他的-內(nèi)酰胺酶耐藥的菌株均應(yīng)該進(jìn)行測(cè)定碳青霉稀類的對(duì)這些菌株的MIC 。,檢測(cè)KPC酶的最佳底物,厄他培南是檢測(cè)KPC酶的最佳底物。如MIC為2μg/ml應(yīng)視作有產(chǎn)KPC酶和其他碳青酶霉烯酶的可能。這時(shí)應(yīng)與臨床醫(yī)師聯(lián)系，并將該菌株送往參考試驗(yàn)室作進(jìn)一步的研究。,檢測(cè)KPC酶,幾種高度耐藥菌感染的抗菌藥選用