細(xì)胞松弛素B預(yù)處理對水牛成熟卵母細(xì)胞玻璃化冷凍效果的影響.pdf

1、水牛成熟卵母細(xì)胞結(jié)構(gòu)復(fù)雜，玻璃化冷凍期間細(xì)胞結(jié)構(gòu)以及理化性質(zhì)易發(fā)生變化，引起紡錘體微管的紊亂，進(jìn)而影響染色體的分布，同時破壞微絲結(jié)構(gòu)。研究表明，細(xì)胞骨架穩(wěn)定劑可以減弱細(xì)胞骨架在冷凍期間的損傷。本試驗將探討冷凍前細(xì)胞松弛素B(CB)預(yù)處理水牛體外成熟卵母細(xì)胞對其玻璃化冷凍保存效果的影響，進(jìn)一步了解玻璃化冷凍的損傷機(jī)制，為改善水牛卵母細(xì)胞冷凍效果指引方向。
　　第一章:研究水牛成熟卵母細(xì)胞玻璃化冷凍前CB處理濃度的優(yōu)化。水牛成熟卵母細(xì)

2、胞在玻璃化冷凍前分別在含有0μg/mL、4μg/mL、8μg/mL、12μg/mL CB的IVM培養(yǎng)液中孵育30 min。結(jié)果表明，與新鮮的對照組相比，玻璃化冷凍均造成卵母細(xì)胞存活率、卵裂率、囊胚率的下降(P＜0.01)。但是冷凍前8μg/mL組的預(yù)處理能夠提高凍融后卵母細(xì)胞卵裂率和囊胚率，與0μg/mL組的相比差異顯著(69.18％ vs43.89％，17.28％ vs10.27％，P＜0.05)，而4μg/mL組和12μg/mL組的

3、預(yù)處理作用效果不明顯。因此選用8μg/mL CB進(jìn)行后續(xù)實驗。
　　第二章:研究用CB預(yù)處理后玻璃化冷凍對水牛成熟卵母細(xì)胞的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)和骨架蛋白的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，成熟卵母細(xì)胞的微管富集在極體處以及以紡錘體形式分布在染色體周圍，呈垂直或者平行的狀態(tài)，而微絲主要聚集在極體處。水牛成熟卵母細(xì)胞在玻璃化冷凍前經(jīng)8μg/mL的CB預(yù)處理，可提高凍融后紡錘體微管結(jié)構(gòu)、染色體形態(tài)與微絲分布正常率，較未處理冷凍組差異顯著(48.99％ vs38

4、.66％，52.14％ vs42.11％，54.59％ vs43.54％，P＜0.05)，但均明顯低于新鮮組(70.57％，77.03％，81.47％，P＜0.01)和新鮮CB處理組(74.72％，76.76％，80.60％，P＜0.01)。此外，對凍融后卵母細(xì)胞微管蛋白和肌動蛋白的含量進(jìn)行分析。結(jié)果表明，經(jīng)8μg/mL CB預(yù)處理，水牛成熟卵母細(xì)胞凍融后微管蛋白的含量顯著高于未處理冷凍組(P＜0.01)，但肌動蛋白的含量在冷凍前后沒有

5、顯著差異(P＞0.05)。
　　第三章:探索CB預(yù)處理水牛成熟卵母細(xì)胞對其凍融后發(fā)育潛能的影響。對凍融后水牛卵母細(xì)胞進(jìn)行胞漿內(nèi)單精子注射和胚胎培養(yǎng)。結(jié)果表明，8μg/mL CB預(yù)處理組的卵母細(xì)胞8-細(xì)胞卵裂率、囊胚率均顯著高于未處理冷凍組(54.50％ vs34.90％，17.08％ vs10.21％，P＜0.05)，但冷凍中處理組與未處理組的第二極體排出率、2-細(xì)胞卵裂率、囊胚率均顯著低于對照組(P＜0.05);對照組的囊胚細(xì)胞