豬生發(fā)泡期卵母細胞的玻璃化冷凍保存.pdf

1、對卵母細胞進行冷凍保存,可以使得卵源不再受到時間和空間的限制,為體外受精、核移植和轉(zhuǎn)基因等胚胎工程技術(shù)的研究提供充足的原材料。豬卵母細胞中富含脂滴,對低溫十分敏感,以致豬卵母細胞冷凍保存的研究進展相對較慢。開展對豬卵母細胞冷凍保存的研究為豬和其他低溫敏感性物種的卵母細胞冷凍保存提供方法。玻璃化冷凍卵母細胞不需要昂貴的儀器,操作方便、快速和高效。本試驗以生發(fā)泡期(germinal vesicle, GV期)的豬卵母細胞為研究對象,研究了預(yù)

2、平衡時間、顆粒細胞和冷凍載體對卵母細胞玻璃化冷凍效果的影響。 為了選擇最佳的豬GV期卵母細胞在玻璃化冷凍液中的平衡時間,將卵母細胞分別用10％乙二醇(ethylene glycol, EG)、20％EG平衡1min、1min(總平衡時間2min)和3min、2min(總平衡時間5min),再通過30％EG的玻璃化冷凍液處理30s,直接裝入半麥管,投入液氮中冷凍保存。解凍后,體外成熟培養(yǎng)44h,用透明質(zhì)酸酶(hyaluronida

3、se,HE)脫除卵丘,臺盼藍染色檢查存活情況,并在體視鏡下觀察第一極體排出情況,統(tǒng)計存活率和成熟率。結(jié)果發(fā)現(xiàn),平衡2min和5min分別得到51.33％、45.16％的存活率,兩者差異不顯著(P>0.05);體外成熟后分別得到了3.54％和10.48％成熟率,差異顯著(P<0.05)：說明平衡5min的冷凍效果優(yōu)于平衡2min;同時表明,冷凍保存豬GV期卵母細胞是可行的。 為了研究顆粒細胞的存在對豬卵母細胞冷凍效果的影響,將包裹

4、有3層以上或2層卵丘的豬卵母細胞在10％、20％和30％的EG分別處理3min、2min和30s后,冷凍解凍后體外成熟培養(yǎng)44h,統(tǒng)計存活率和成熟率；對照組卵母細胞不經(jīng)冷凍直接體外成熟培養(yǎng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),包裹有3層以上顆粒細胞的卵母細胞和包裹2層顆粒細胞的卵冷凍解凍后分別得到18.18％、42.11％的存活率,兩者差異極顯著(P<0.01),均與對照組差異極顯著(P<0.01),對照組之間差異不顯著(P>0.05);體外成熟后,包裹有3層以

5、上顆粒細胞的卵母細胞和2層顆粒細胞包裹的卵分別得到了4.55％、9.77％的成熟率,兩者差異不顯著(P>0.05),但與對照組差異均極顯著(P<0.01),對照組之間差異不顯著。說明脫除部分卵丘可以降低冷凍對卵母細胞造成的損傷。 為研究冷凍載體對豬卵母細胞冷凍效果的,將豬卵母細胞在10％、20％和30％EG中平衡3min、2min和30s后,分別裝入開口式拉長麥管(open pull straw,OPS)管和半麥管,冷凍解凍后體

6、外成熟培養(yǎng)44 h,檢查存活和成熟情況；對照組不經(jīng)冷凍直接體外成熟。結(jié)果表明,用OPS法、半麥管法冷凍豬GV期卵母細胞存活率分別為51.47％、55.41％和成熟率分別為8.82％、10.81％,兩者之間差異不顯著(P>0.05),但均與對照組存活率和成熟率94.12％、69.12％差異極顯著(P<0.01)。結(jié)果說明半麥管法和OPS法冷凍效果相同,同樣適合于豬GV期卵母細胞的冷凍保存。綜合本試驗的結(jié)果表明,豬GV期卵母細胞玻璃化冷凍保