豬生發(fā)泡期卵母細(xì)胞的玻璃化冷凍保存.pdf

1、對(duì)卵母細(xì)胞進(jìn)行冷凍保存,可以使得卵源不再受到時(shí)間和空間的限制,為體外受精、核移植和轉(zhuǎn)基因等胚胎工程技術(shù)的研究提供充足的原材料。豬卵母細(xì)胞中富含脂滴,對(duì)低溫十分敏感,以致豬卵母細(xì)胞冷凍保存的研究進(jìn)展相對(duì)較慢。開展對(duì)豬卵母細(xì)胞冷凍保存的研究為豬和其他低溫敏感性物種的卵母細(xì)胞冷凍保存提供方法。玻璃化冷凍卵母細(xì)胞不需要昂貴的儀器,操作方便、快速和高效。本試驗(yàn)以生發(fā)泡期(germinal vesicle, GV期)的豬卵母細(xì)胞為研究對(duì)象,研究了預(yù)

2、平衡時(shí)間、顆粒細(xì)胞和冷凍載體對(duì)卵母細(xì)胞玻璃化冷凍效果的影響。 為了選擇最佳的豬GV期卵母細(xì)胞在玻璃化冷凍液中的平衡時(shí)間,將卵母細(xì)胞分別用10％乙二醇(ethylene glycol, EG)、20％EG平衡1min、1min(總平衡時(shí)間2min)和3min、2min(總平衡時(shí)間5min),再通過30％EG的玻璃化冷凍液處理30s,直接裝入半麥管,投入液氮中冷凍保存。解凍后,體外成熟培養(yǎng)44h,用透明質(zhì)酸酶(hyaluronida

3、se,HE)脫除卵丘,臺(tái)盼藍(lán)染色檢查存活情況,并在體視鏡下觀察第一極體排出情況,統(tǒng)計(jì)存活率和成熟率。結(jié)果發(fā)現(xiàn),平衡2min和5min分別得到51.33％、45.16％的存活率,兩者差異不顯著(P>0.05);體外成熟后分別得到了3.54％和10.48％成熟率,差異顯著(P<0.05)：說明平衡5min的冷凍效果優(yōu)于平衡2min;同時(shí)表明,冷凍保存豬GV期卵母細(xì)胞是可行的。 為了研究顆粒細(xì)胞的存在對(duì)豬卵母細(xì)胞冷凍效果的影響,將包裹

4、有3層以上或2層卵丘的豬卵母細(xì)胞在10％、20％和30％的EG分別處理3min、2min和30s后,冷凍解凍后體外成熟培養(yǎng)44h,統(tǒng)計(jì)存活率和成熟率；對(duì)照組卵母細(xì)胞不經(jīng)冷凍直接體外成熟培養(yǎng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),包裹有3層以上顆粒細(xì)胞的卵母細(xì)胞和包裹2層顆粒細(xì)胞的卵冷凍解凍后分別得到18.18％、42.11％的存活率,兩者差異極顯著(P<0.01),均與對(duì)照組差異極顯著(P<0.01),對(duì)照組之間差異不顯著(P>0.05);體外成熟后,包裹有3層以

5、上顆粒細(xì)胞的卵母細(xì)胞和2層顆粒細(xì)胞包裹的卵分別得到了4.55％、9.77％的成熟率,兩者差異不顯著(P>0.05),但與對(duì)照組差異均極顯著(P<0.01),對(duì)照組之間差異不顯著。說明脫除部分卵丘可以降低冷凍對(duì)卵母細(xì)胞造成的損傷。 為研究冷凍載體對(duì)豬卵母細(xì)胞冷凍效果的,將豬卵母細(xì)胞在10％、20％和30％EG中平衡3min、2min和30s后,分別裝入開口式拉長麥管(open pull straw,OPS)管和半麥管,冷凍解凍后體

6、外成熟培養(yǎng)44 h,檢查存活和成熟情況；對(duì)照組不經(jīng)冷凍直接體外成熟。結(jié)果表明,用OPS法、半麥管法冷凍豬GV期卵母細(xì)胞存活率分別為51.47％、55.41％和成熟率分別為8.82％、10.81％,兩者之間差異不顯著(P>0.05),但均與對(duì)照組存活率和成熟率94.12％、69.12％差異極顯著(P<0.01)。結(jié)果說明半麥管法和OPS法冷凍效果相同,同樣適合于豬GV期卵母細(xì)胞的冷凍保存。綜合本試驗(yàn)的結(jié)果表明,豬GV期卵母細(xì)胞玻璃化冷凍保