液氦玻璃化冷凍牛未成熟卵母細(xì)胞的研究.pdf

1、哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞的冷凍保存是生命科學(xué)領(lǐng)域的重要研究?jī)?nèi)容之一，近年來(lái)，盡管人們對(duì)此進(jìn)行了大量的研究，但卵母細(xì)胞冷凍保存的效果仍不理想，尤其是未成熟卵母細(xì)胞的冷凍效果更差。影響卵母細(xì)胞玻璃化冷凍效果的因素很多，其中降溫速率被認(rèn)為是最重要的影響因素。目前，卵母細(xì)胞玻璃化冷凍主要采用液氮(-196℃)為冷源，而液氦的溫度可以達(dá)到-269℃，本課題擬在液氮 OPS玻璃化冷凍的基礎(chǔ)上，嘗試以溫度更低的液氦為冷源，通過(guò)加快降溫速率來(lái)改進(jìn)牛未成熟卵母細(xì)

2、胞的冷凍效果，建立并優(yōu)化牛未成熟卵母細(xì)胞的液氦玻璃化冷凍方法。
　　1.牛未成熟卵母細(xì)胞液氮OPS玻璃化冷凍方法的建立
　　試驗(yàn)1：OPS管拉制方法研究。分別以水浴鍋、普通酒精燈和自制小酒精燈為熱源，探究 OPS管的拉制方法。結(jié)果表明，水浴鍋和普通酒精燈均無(wú)法拉制出符合要求的OPS管，只有自制小酒精燈可以拉制出內(nèi)徑和管壁厚度分別為0.8 mm和0.07 mm左右的OPS管。
　　試驗(yàn)2：細(xì)管法和 OPS玻璃化冷凍法的對(duì)

3、比。將采集到的 COCs隨機(jī)分為3組，對(duì)照組、細(xì)管組和 OPS組。對(duì)照組不經(jīng)冷凍直接進(jìn)行 IVM、IVF和早期胚胎 IVC。兩個(gè)冷凍組分別用細(xì)管法和 OPS法進(jìn)行玻璃化冷凍，解凍后分別進(jìn)行 IVM、IVF和早期胚胎 IVC。結(jié)果顯示：與對(duì)照組卵母細(xì)胞的形態(tài)正常率、成熟率、卵裂率和囊胚率(100％、86.1%、69.7%和38.2%)相比，兩冷凍組的各項(xiàng)指標(biāo)均顯著降低(P＜0.05)。在兩個(gè)冷凍組中，細(xì)管組和 OPS組卵母細(xì)胞的形態(tài)正常率

4、分別為65.2%和77.8%，成熟率分別為31.0%和41.6%，卵裂率分別為19.9%和29.8%，囊胚率分別為0和7.0%。OPS組上述指標(biāo)均明顯高于細(xì)管組(P＜0.05)。
　　結(jié)論：用自制小酒精燈更易于拉制出適于玻璃化冷凍的 OPS管；液氮 OPS法玻璃化冷凍牛未成熟卵母細(xì)胞的效果優(yōu)于細(xì)管法。
　　2.牛未成熟卵母細(xì)胞液氦OPS玻璃化冷凍方法的探索
　　將采集到的COCs隨機(jī)分為3組，對(duì)照組、液氮組和液氦組。對(duì)

5、照組不經(jīng)冷凍直接進(jìn)行 IVM、IVF和早期胚胎 IVC。兩個(gè)冷凍組分別以液氮和液氦為冷源，以 OPS管為載體對(duì)牛未成熟卵母細(xì)胞進(jìn)行玻璃化冷凍，解凍后分別進(jìn)行IVM、IVF和早期胚胎 IVC。結(jié)果顯示：與對(duì)照組卵母細(xì)胞的形態(tài)正常率、成熟率、卵裂率和囊胚率(100%、87.0%、69.5%和42.0%)相比，兩冷凍組的各項(xiàng)指標(biāo)均顯著降低(P＜0.05)。在兩個(gè)冷凍組中，液氦組解凍后卵母細(xì)胞的形態(tài)正常率(84.7%)顯著高于液氮組(78.5%

6、；P＜0.05)。經(jīng)過(guò)體外成熟后，液氦組卵母細(xì)胞的成熟率(43.9%)顯著高于液氮組(39.2%； P＜0.05)。經(jīng)過(guò)體外受精和早期胚胎體外培養(yǎng)后，液氦組的卵裂率和囊胚率(35.4%和6.4%)顯著高于液氮組(30.0%和4.1%；P＜0.05)。結(jié)論：液氦 OPS玻璃化冷凍法的效果優(yōu)于液氮法；液氦作為冷源冷凍保存牛未成熟卵母細(xì)胞是可行的。
　　3.液氦OPS玻璃化冷凍方法的優(yōu)化試驗(yàn)
　　試驗(yàn)1：最佳冷凍保護(hù)液的篩選。將采

7、集到的COCs隨機(jī)分為6組，其中一組不經(jīng)冷凍，作為對(duì)照組，其余五組分別使用五種濃度的冷凍保護(hù)液(EDS30、EDS35、EDS40、EDS45和EDS50)進(jìn)行液氦OPS法玻璃化冷凍，解凍后分別進(jìn)行 IVM、IVF和早期胚胎 IVC。結(jié)果顯示：與對(duì)照卵母細(xì)胞的形態(tài)正常率、成熟率、卵裂率和囊胚率(100%、84.5%、69.9%和41.1%)相比，所有冷凍組的各項(xiàng)指標(biāo)均顯著降低(P＜0.05)。在五個(gè)冷凍組中， EDS35組卵母細(xì)胞(90

8、.3%、51.9%、41.8%和10.0%)冷凍-解凍后的冷凍效果均顯著高于其他四組(P＜0.05)。EDS50組(75.1%、36.0%、27.2%和2.6%)的冷凍效果最差，顯著低于其他四組(P＜0.05)。EDS30(83.0%、42.0%、33.8%和6.5%)、EDS40(84.9%、43.9%、34.9%和6.4%)、EDS45(82.6%、42.4%、33.2%和5.1%)組之間的差異均不顯著(P﹥0.05)。
　　

9、試驗(yàn)2：液氦玻璃化冷凍中兩種操作溫度的對(duì)比。將采集到的 COCs隨機(jī)分為三組，對(duì)照組、39℃組和25℃組。對(duì)照組不經(jīng)冷凍直接進(jìn)行IVM、IVF和早期胚胎 IVC。兩個(gè)液氦 OPS法玻璃化冷凍組除操作溫度不同外，其他操作均相同，解凍后分別進(jìn)行 IVM、IVF和早期胚胎 IVC。結(jié)果表明：與對(duì)照組卵母細(xì)胞的形態(tài)正常率、成熟率、卵裂率和囊胚率(100%、84.6%、71.5%和40.6%)相比，兩個(gè)冷凍組的各項(xiàng)指標(biāo)均顯著降低(P＜0.05)。

10、兩個(gè)冷凍組中，39℃組和25℃組中的形態(tài)正常率分別為89.2%和85.8%，差異不顯著(P﹥0.05)。39℃組卵母細(xì)胞的成熟率、卵裂率、囊胚率分別是51.4%、41.2%和10.0%，均顯著高于25℃組(45.7%、34.1%和6.3%；P＜0.05)。
　　試驗(yàn)3：最佳預(yù)處理時(shí)間的篩選。將采集到的 COCs隨機(jī)分為四組，對(duì)照組、1 min預(yù)處理組、3 min預(yù)處理組和5 min預(yù)處理組。對(duì)照組不經(jīng)冷凍直接進(jìn)行 IVM、IVF和

11、早期胚胎 IVC。三個(gè)液氦 OPS法玻璃化冷凍組除在冷凍平衡液(VS1)中的預(yù)處理時(shí)間不同外，其他操作均相同。解凍后分別進(jìn)行 IVM、IVF和早期胚胎IVC，結(jié)果顯示：與對(duì)照組卵母細(xì)胞的形態(tài)正常率、成熟率、卵裂率和囊胚率(100%、84.0%、70.6%和40.1%)相比，三個(gè)冷凍組的各項(xiàng)指標(biāo)均顯著降低(P＜0.05)。三個(gè)冷凍組中，1 min組、3 min組和5 min組解凍后卵母細(xì)胞的形態(tài)正常率分別為87.7%、87.2%和86.4