microR-19a-b調(diào)控CUL5并促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖和侵襲.pdf

1、[目的]微小RNA(microRNA，miRNA)是一類非編碼調(diào)控單鏈小分子RNA。他們代表了一類重要的新的生物調(diào)控分子，在許多生物學(xué)過程中有著很重要的作用，包括生長、分化、凋亡、病毒感染和癌癥發(fā)展。宮頸癌是全球女性的常見腫瘤之一，其發(fā)生和發(fā)展是多基因共同參與，多步驟完成的復(fù)雜過程。前期工作利用寡核苷酸微陣列技術(shù)檢測了宮頸癌組織及其對應(yīng)正常宮頸組織中miRNA的表達(dá)譜差異，發(fā)現(xiàn)miR-19a、miR-19b在宮頸癌中高表達(dá)。本研究應(yīng)用R

2、eal-time PCR技術(shù)驗證了這一結(jié)果，然后研究了miR-19a和miR-19b對宮頸癌細(xì)胞生長表型的影響，進(jìn)一步確定miR-19a、miR-19b直接作用的共同靶基因，并尋找miR-19a和miR-19b對宮頸癌發(fā)生和發(fā)展的分子機制。
　　[方法]首先，我們應(yīng)用Real time PCR技術(shù)檢測miR-19a、miR-19b在人類宮頸癌組織和癌旁正常組織中的差異表達(dá)。用WST-1，集落形成實驗和細(xì)胞生長曲線等檢測miR-19

3、a、miR-19b對宮頸癌細(xì)胞系HeLa和C33A的生長活性的影響。我們用生物信息學(xué)方法預(yù)測和篩選了miR-19a和miR-19b的候選靶基因CUL5，并且用熒光報告載體實驗驗證了miR-19a和miR-19b對CUL5的直接調(diào)控作用。通過Real time PCR技術(shù)和Western blot方法在宮頸癌細(xì)胞系中檢測miR-19a和miR-19b對CUL5的mRNA和蛋白水平的影響。最后利用挽救實驗過表達(dá)CUL5和RNA干擾技術(shù)沉默C

4、UL5后，用WST-1實驗、生長曲線實驗、集落形成實驗和Transwell實驗檢測了細(xì)胞表型的變化，進(jìn)一步研究靶基因的功能。
　　[結(jié)果]Real time PCR結(jié)果顯示，與正常宮頸癌組織相比，癌組織內(nèi)miR-19a和miR-19b的表達(dá)明顯升高，而CUL5的mRNA和蛋白水平明顯降低。Real timePCR和Westem blot的結(jié)果表明miR-19a和miR-19b能夠影響CUL5 mRNA和蛋白的表達(dá)水平。過表達(dá)miR

5、-19a和miR-19b，宮頸癌細(xì)胞的增殖能力，侵襲能力和生長能力均增強了，然而封閉miR-19a和miR-19b后，通過誘導(dǎo)CUL5的表達(dá)，使得宮頸癌細(xì)胞的侵襲，增殖和生長能力受到抑制。熒光報告載體實驗表明，miR-19a和miR-19b能夠通過作用于CUL5基因的3’非翻譯區(qū)(3’UTR)的特定位點，對其表達(dá)進(jìn)行負(fù)性調(diào)節(jié)。在宮頸癌細(xì)胞中，挽救CUL5與封閉miR-19a和miR-19b對細(xì)胞的表型影響一致，而沉默CUL5后與過表達(dá)m