瘦素對于體外培養(yǎng)人類軟骨細(xì)胞影響的初步研究.pdf

1、背景：骨關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)是中老年人的常見的關(guān)節(jié)疾患，重要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)軟骨退變、磨損、骨質(zhì)增生，導(dǎo)致關(guān)節(jié)腫脹、疼痛、畸形和功能障礙等，嚴(yán)重的影響人們的日常生活。骨關(guān)節(jié)炎的病理改變中，軟骨細(xì)胞和軟骨基質(zhì)的改變占重要地位。瘦素是由白色脂肪組織分泌的一種激素，具有多種作用，近來的研究發(fā)現(xiàn)，瘦素受體在骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞上表達(dá)，關(guān)節(jié)滑液內(nèi)也發(fā)現(xiàn)瘦素存在，為了研究瘦素對軟骨細(xì)胞的作用，探索瘦素在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病及發(fā)展中的地位，本文

2、進(jìn)行了本研究，希望能為臨床防治骨關(guān)節(jié)炎提供參考。 研究目的 通過分離培養(yǎng)人類軟骨細(xì)胞，進(jìn)行下列研究： 1．測定瘦素在不同人群軟骨細(xì)胞中的表達(dá)量，從而確定瘦素是否與OA的發(fā)病相關(guān)。 2．觀察不同濃度瘦素對于軟骨細(xì)胞增殖的作用，篩選出合適的藥物濃度和作用時(shí)間。 3．以瘦素刺激軟骨細(xì)胞，提取總RNA，通過基因芯片技術(shù)比較瘦素對于軟骨細(xì)胞基囚的影響。 4．根據(jù)基因芯片的篩選，在蛋白水平驗(yàn)證瘦素對于

3、軟骨細(xì)胞細(xì)胞因子表達(dá)的影響。 5．觀察瘦素對細(xì)胞凋亡的作用。 研究方法 1．人類軟骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)和鑒定：取手術(shù)中取出的軟骨塊，經(jīng)機(jī)械分離、消化，使用組織貼塊法體外培養(yǎng)軟骨細(xì)胞，并經(jīng)Ⅱ型膠原免疫組化染色，證實(shí)是否培養(yǎng)出軟骨細(xì)胞。 2．分別使用不同濃度的瘦素，加入軟骨細(xì)胞培養(yǎng)基中，使用CCK-8和細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測，觀察不同時(shí)間點(diǎn)，不同濃度瘦素對于軟骨細(xì)胞增殖的影響。 3．選取對軟骨細(xì)胞增殖影響明顯的瘦

4、素濃度，加入培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞中，使用試劑盒提取總RNA，并將提取的總RNA進(jìn)行基因芯片比對分析，從而篩選出差異基因。 4．選取相同濃度得瘦素加入培養(yǎng)的人軟骨細(xì)胞，同時(shí)使用ELISA方法，在蛋白水平驗(yàn)證差異基因。 5．使用流式細(xì)胞儀和電鏡，檢測瘦素對于軟骨細(xì)胞凋亡和周期的影響。 研究結(jié)果 1．手術(shù)中取出的軟骨組織，經(jīng)機(jī)械分離和消化，貼塊法培養(yǎng)出細(xì)胞，經(jīng)Ⅱ型膠原免疫組化染色為陽性，證實(shí)是軟骨細(xì)胞。 2．

5、體外培養(yǎng)OA組軟骨細(xì)胞的瘦素表達(dá)明顯高于正常人群組的軟骨細(xì)胞，證實(shí)瘦素與OA的發(fā)病間存在著相關(guān)性。 3．不同濃度的瘦素刺激軟骨細(xì)胞，10ng/ml濃度的瘦素作用48小時(shí)對于軟骨細(xì)胞增殖的抑制作用較為明顯且平穩(wěn)。 4．經(jīng)10ng/ml的瘦素處理48小時(shí)的細(xì)胞，RNA提取后進(jìn)行基因比對，MMP、細(xì)胞骨架、TGF-β1、凋亡基因、膠原的表達(dá)均有差異，IGF-1的表達(dá)無明顯差異。 5．ELISA方法證實(shí)，在蛋白水平TGF

6、-β1、IGF-1表達(dá)無明顯差異，免疫組化半定量得出同樣結(jié)果。 6．流式細(xì)胞術(shù)和電鏡證實(shí)瘦素能夠促進(jìn)軟骨細(xì)胞凋亡，同時(shí)抑制細(xì)胞DNA合成。 結(jié)論 1．通過機(jī)械解離、消化及組織貼塊培養(yǎng)出軟骨細(xì)胞，為下一步關(guān)節(jié)軟骨的研究奠定了良好的基礎(chǔ)。 2．瘦素在10ng/ml，水平對于軟骨細(xì)胞的增殖有抑制作用，而這一濃度正與骨關(guān)節(jié)炎時(shí)的關(guān)節(jié)液中瘦素水平相符，其在不同人群中抑制作用不同，其中可能存在正反饋機(jī)制。 3