松材線蟲、相似穿孔線蟲半胱氨酸蛋白酶基因的分離與特性分析.pdf

1、半胱氨酸蛋白酶(Cysteineprotease，CP)是一類在酶的活性中心含有半胱氨酸殘基的蛋白水解酶。線蟲的半胱氨酸蛋白酶大多表達(dá)在蟲體的食道腺、腸細(xì)胞中，發(fā)揮其水解活性，是線蟲的主要“消化酶”。半胱氨酸蛋白酶在線蟲的入侵組織或細(xì)胞、提供胚胎發(fā)育所需要的營養(yǎng)成分、蛻皮、消化宿主蛋白、免疫逃避等過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，與多種重要?jiǎng)又参锛膊∶芮邢嚓P(guān)，是近年來備受關(guān)注的一類靶標(biāo)蛋白酶。已有大量報(bào)道證明半胱氨酸蛋白酶在動(dòng)物寄生性線蟲、自由生活線

2、蟲的發(fā)育、免疫活性等方面都具有關(guān)鍵作用。而在植物固著性寄生線蟲(如大豆胞囊線蟲、根結(jié)線蟲)中的幾例報(bào)道也預(yù)示了它的重要性，而在植物遷移性寄生線蟲中至今未見對其的報(bào)道。因此，本研究分別從兩種植物遷移性內(nèi)寄生線蟲：松材線蟲(Bursaphelenchusxylophilus)和相似穿孔線蟲(Radopholussimilis)中分離得到半胱氨酸蛋白酶基因全長及片段，并對松材線蟲半胱氨酸蛋白酶進(jìn)行原核表達(dá)。本研究為進(jìn)一步測定蛋白酶活性，更好的

3、了解此蛋白酶的功能奠定了理論基礎(chǔ)，也為植物寄生性線蟲的防治提供新的靶標(biāo)和思路。主要研究結(jié)果如下： 1.克隆基因全長：采用同源克隆法，首先篩選GenBank(www.ncbi.nlm.nih.gov)中收錄的線蟲半胱氨酸蛋白酶(CP)的氨基酸序列，利用DNAman軟件進(jìn)行同源比對分析并根據(jù)植物寄生性線蟲CP密碼子偏好設(shè)計(jì)簡并引物，通過RACE法獲得植物遷移性寄生線蟲：松材線蟲、相似穿孔線蟲CP基因的cDNA全長并進(jìn)行深入分析。本研

4、究從松材線蟲中得到兩個(gè)L型半胱氨酸蛋白酶基因，分別命名為Bx-CPL1、Bx-CPL2，其cDNA全長分別為1220bp、1161bp，GenBank登錄號依次為EU651860、EU659123；從相似穿孔線蟲中得到一個(gè)L型半胱氨酸蛋白酶基因和一個(gè)S型半胱氨酸蛋白酶基因，分別命名為Rs-CPL1和Rs-CPS，其中Rs-CPL1的cDNA全長為1388bp，登錄號EU659124；Rs-CPScDNA全長為1112bp，登錄號EU65

5、9125；同時(shí)從相似穿孔線蟲中得到498bp的L型半胱氨酸蛋白酶基因cDNA片段。生物信息學(xué)軟件詳細(xì)分析以上序列及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果證明這四個(gè)基因全長及一個(gè)cDNA片段均具有CP家族的典型特征。 2.基因DNA全長擴(kuò)增：以松材線蟲基因組DNA為模板，擴(kuò)增松材線蟲兩個(gè)CP基因Bx-CPL1、Bx-CPL2的DNA全長，結(jié)果表明松材線蟲這兩個(gè)目的基因均由3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子組成，獲得了松材線蟲CP基因結(jié)構(gòu)上的基本信息。