馬鈴薯Y病毒分子檢測試劑盒的研制及株系普查.pdf

1、馬鈴薯Y病毒(PotatovirusY，PVY)對(duì)馬鈴薯的危害最大，可導(dǎo)致馬鈴薯退化，降低馬鈴薯產(chǎn)量，嚴(yán)重時(shí)減產(chǎn)可達(dá)80％以上，甚至絕產(chǎn)。解決這一問題的重要途徑是培養(yǎng)脫毒種薯或種苗，而高效可靠的病毒檢測手段是確保脫毒種薯或種苗無毒的前提和關(guān)鍵。因此，建立快速、靈敏、規(guī)范化的病毒檢測體系成為馬鈴薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展的必然趨勢。 檢測試劑盒的出現(xiàn)極大推動(dòng)了脫毒馬鈴薯生產(chǎn)的發(fā)展。由于具有穩(wěn)定、快捷、易于操作等優(yōu)點(diǎn)，很多試劑盒己成為馬鈴薯病毒檢測

2、中的重要工具。目前，國內(nèi)應(yīng)用的分子檢測試劑盒主要是進(jìn)口產(chǎn)品。本研究旨在開發(fā)供脫毒種苗生產(chǎn)單位使用的一步RT-PCR檢測試劑盒。 根據(jù)馬鈴薯Y病毒外殼蛋白(CP)基因序列設(shè)計(jì)合成了一對(duì)引物L(fēng)IU-PVY1、LIU-PVY2，以帶毒樣品植物總RNA為模板，通過RT-PCR檢測技術(shù)擴(kuò)增得到340bp的目的條帶，而健康對(duì)照無此目的條帶，從而建立了PVY的常規(guī)RT-PCR檢測技術(shù)。以此為基礎(chǔ)，在同一個(gè)反應(yīng)中同時(shí)加入反轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)所需試

3、劑，反應(yīng)程序中包括反轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)所需條件，建立了PVY的一步RT-PCR檢測技術(shù)。 反應(yīng)體系的優(yōu)化：確立了M-MLV濃度、r-Tag酶濃度、dNTP的質(zhì)量與濃度、Mg2+濃度及PCR反應(yīng)的退火溫度、時(shí)間和循環(huán)次數(shù)等。本研究采用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)技術(shù)，分析和比較了四對(duì)通用引物(引物NIE-PVY和PVYj來源于加拿大馬鈴薯中心，引物PVYsp是國內(nèi)報(bào)道的引物，引物L(fēng)IU-PVY由黑龍江省農(nóng)科院設(shè)計(jì))，得劍引

4、物L(fēng)IU-PVY和PVYsp的通用性和特異性較強(qiáng)。 另外，試驗(yàn)采用了SDS提取法、Trizol提取法和蛋白酶K法抽提植物總RNA，測得的OD260＼OD280值均大于1.70，大小順序?yàn)椋篢rizol法＞蛋白酶K法＞SDS法。將三種方法提取的RNA進(jìn)行凝膠電泳和RT-PCR產(chǎn)物的電泳分析表明，Trizol法提取的RNA完整性較好，純度較高。再加之Trizol法簡捷易行，節(jié)省時(shí)間等優(yōu)點(diǎn)，選擇Trizol法提取植物總RNA，并將其作

5、為試劑盒中植物總RNA的提取方法。 根據(jù)上述的研究結(jié)果，設(shè)計(jì)并組裝了馬鈴薯Y病毒的一步RT-PCR檢測試劑盒。針對(duì)通用性、靈敏度和特異性等方面對(duì)試劑盒進(jìn)行驗(yàn)證，該試劑盒具有良好的穩(wěn)定性和特異性，靈敏度可以檢測劍帶毒植物組織下限的6.25μg，高于ELISA(0.1～10ng/mL)和NASH(15μg左右)的靈敏度，雖然和常規(guī)方法的靈敏度相同，但更為快速、簡便、易于操作，適合脫毒種苗和種薯生產(chǎn)單位做大量樣品的檢測。 黑龍

6、江省PVYO系、PVYN系和PVYC系的發(fā)生情況調(diào)查表明：在總體上，PVYO的檢出率為83.24％;PVYN的檢出率為73.41％：PVYC為0％。PVYO檢出率高出PVYN9.83個(gè)百分點(diǎn)，PVYN和PVYO的復(fù)合侵染率為56.65％。 利用引物SP3、SP4和SP5，以帶毒樣品植物總RNA為模板，通過RT-PCR檢測技術(shù)PVYN樣品擴(kuò)增得到544bp的目的條帶，PVYO樣品擴(kuò)增得劍672bp的目的條帶，而健康對(duì)照無此目的條帶