葡萄栓皮病分子檢測研究及試劑盒開發(fā).pdf

1、葡萄栓皮病是危害葡萄生產(chǎn)的重要病毒病害，樹體一旦被病毒侵染，將終生帶毒，輕者樹體生長不良，產(chǎn)量下降，品質(zhì)變劣，重者果實(shí)畸形不堪食用，失去商品價(jià)值，更甚者衰退枯死，由此造成的經(jīng)濟(jì)損失難以估測。迄今為止還沒有一種有效的藥物可以防治，目前較為可行的控制措施是實(shí)行檢疫，控制其擴(kuò)散。本研究的目的是建立快速、準(zhǔn)確、實(shí)用的葡萄病毒B的檢測試劑盒，以期解決種苗檢疫、抗病性早期鑒定等基本問題，為葡萄無毒化栽培提供基本保障，因而葡萄病毒B的檢測技術(shù)研究具有

2、非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。 隨機(jī)選取石河子多年生葡萄植株作為試驗(yàn)材料，通過研究影響總RNA提取的因素，提取出高質(zhì)量的總RNA；建立葡萄病毒B兩步RT-PCR體系，將擴(kuò)增的特異性片段進(jìn)行克隆測序，測序結(jié)果與NCBI中所提交的登陸號為X75448的核酸序列進(jìn)行比對；利用克隆質(zhì)粒合成cDNA探針，對隨機(jī)采取的19個(gè)樣品進(jìn)行斑點(diǎn)雜交試驗(yàn)；在建立兩步RT-PCR體系的基礎(chǔ)之上，建立并優(yōu)化了一步RT-PCR和斑點(diǎn)雜交優(yōu)化體系，最后合成一步RT-P

3、CR與斑點(diǎn)雜交檢測試劑盒，并對試劑盒的特異性和穩(wěn)定性進(jìn)行檢驗(yàn)。 本研究的主要結(jié)論如下： 1．本試驗(yàn)以葡萄韌皮部為試材，采用改進(jìn)的SDS法提取總RNA，提取的總RNA具有帶型完整、濃度高、存放時(shí)間長的優(yōu)點(diǎn)。 2．以提取的總RNA為模板，利用特異性引物進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，獲得長度約為460bp的特異性片段。對特異性片段進(jìn)行回收、連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1，經(jīng)藍(lán)白斑篩選后，活化細(xì)菌，提取質(zhì)粒，送上海生工進(jìn)行測序。測序結(jié)