結(jié)構(gòu)域突變對(duì)WSSV囊膜蛋白VP28免疫原性及抗病性的影響.pdf

1、由對(duì)蝦白斑綜合征病毒(WSSV)引起的對(duì)蝦白斑綜合征(WSS)是全球?qū)ξr養(yǎng)殖業(yè)所面臨的危害最大，傳播最廣的病害之一，至今已席卷了世界上主要的對(duì)蝦養(yǎng)殖地區(qū)，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。但目前尚無(wú)有效的防治手段。大量研究已經(jīng)表明囊膜蛋白VP28與WSSV的系統(tǒng)感染有關(guān)，但對(duì)VP28蛋白具體發(fā)揮作用的功能位點(diǎn)尚不清楚。本研究主要通過(guò)對(duì)VP28蛋白進(jìn)行不同結(jié)構(gòu)域的缺失表達(dá)，研究各結(jié)構(gòu)域?qū)SSV系統(tǒng)感染的作用。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下：
　　

2、1)通過(guò)設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增得到三種不同結(jié)構(gòu)基因缺失的重組VP28基因，并在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，經(jīng)過(guò)柱純化后，分別用SDS-PAGE和Western-blot進(jìn)行蛋白分析。結(jié)果表明，三組蛋白：疏水域缺失重組表達(dá)蛋白(VP28N)，糖基化位點(diǎn)集中區(qū)缺失重組表達(dá)蛋白(VP28C)，抗原決定簇集中區(qū)缺失重組表達(dá)蛋白(VP28M)，在大腸桿菌中進(jìn)行了有效的表達(dá)，各重組蛋白大小分別為35.4kDa、38.5kDa、41.3kDa。
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3、)各重組表達(dá)蛋白VP28C、VP28N、VP28M和VP28經(jīng)超濾膜過(guò)濾除菌后，與弗氏佐劑進(jìn)行乳化，采取背部皮下多點(diǎn)注射的方法免疫兔子，經(jīng)3-4次免疫之后，獲得分別抗四種重組蛋白的多克隆抗體血清。對(duì)多抗血清進(jìn)行ELISA和Western-blot分析，結(jié)果顯示，四種多抗血清都有較高的抗體效價(jià)，且特異性識(shí)別程度高。
　　 3)以克氏原螯蝦為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ絼?dòng)物，進(jìn)行了四種重組蛋白在蝦上對(duì)WSSV的免疫保護(hù)試驗(yàn)，四種重組蛋白的多克隆抗體與W

4、SSV的中和試驗(yàn)。免疫試驗(yàn)表明，四種蛋白在免疫螯蝦后均能提高螯蝦抗WSSV感染的能力，其中VP28C的免疫保護(hù)率達(dá)到了53.85％，免疫保護(hù)作用最為明顯；中和試驗(yàn)結(jié)果表明，四種蛋白的多克隆抗體均能不同程度抑制WSSV的感染能力，并以VP28C蛋白的多抗效果最好。在體外培養(yǎng)的螯蝦血細(xì)胞后進(jìn)行體外中和試驗(yàn)結(jié)果也表明VP28C多抗中和WSSV的效果最好。分析表明在WSSV感染細(xì)胞過(guò)程中囊膜VP28的主要功能結(jié)構(gòu)域在VP28C內(nèi)，即VP28蛋白