表達IBV S1蛋白抗原表位的含雞源啟動子的真核表達質粒的構建及其免疫原性檢測.pdf

1、真核表達載體中表達外源基因的組件主要包括:(1)啟動子和增強子;(2)轉錄、終止信號;(3)加polyA信號;(4)選擇或篩選標記。啟動子和增強子具有種屬和組織特異性，其作用在不同來源的細胞中有很大區(qū)別。為研究啟動子對真核表達系統(tǒng)表達外源基因的影響，構建專門適用于雞體內進行外源基因表達的真核表達載體，本試驗將真核表達載體pcDNA3.1和pCIneo的CMV啟動子替換為雞β-actin啟動子，并對IBV ZY3株的S1蛋白抗原表位基因進

2、行真核表達。主要試驗內容有:
　　根據(jù)GenBank中β-actin啟動子（登錄號為:DI038975）的基因序列設計引物，在上、下游引物5'端分別引入適用于克隆至兩種真核質粒pcDNA3.1和pCIneo的酶切位點。提取雞淋巴細胞基因組DNA作為模版，通過PCR擴增獲得雞β-actin啟動子序列，并用β-actin啟動子替換掉pcDNA3.1和pCIneo中的CMV啟動子，獲得重組真核表達載體pcDNA-act和pCIneo-a

3、ct。將EGFP基因克隆至載體的多克隆酶切位點中，獲得含有EGFP報告基因的重組質粒pcDNA-EGFP，pcDNA-act-EGFP，pCIneo-EGFP和pCIneo-act-EGFP。將4種質粒分別轉染雞胚成纖維細胞(CEF)，24 h后通過熒光倒置顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達情況。結果顯示:在轉染CEF24 h后，pcDNA-act-EGFP和pCIneo-act-EGFP轉染的細胞中可觀察到熒光，而pcDNA-EGFP和pC

4、Ineo-EGFP轉染的細胞中36h后才可見熒光，4種質粒轉染的細胞均在5d后達到最大表達量。啟動子替換后的重組質粒在轉染細胞中的綠色熒光蛋白的表達量明顯多于未替換啟動子的重組質粒。
　　根據(jù)IBV ZY3株S1蛋白抗原表位基因序列設計引物，以含S1蛋白抗原表位基因的質粒PMD19-S1為模版擴增S1蛋白抗原表位基因，并將其分別亞克隆至啟動子替換前后的真核載體中，獲得含S1蛋白抗原表位基因的重組質粒pcDNA-S1，pcDNA-a

5、ct-S1，pCIneo-S1和pCIneo-act-S1。將重組質粒轉染至雞胚成纖維細胞(CEF)中，采用間接免疫熒光法檢測轉染細胞中S1蛋白的表達，結果顯示啟動子替換后的真核質粒轉染細胞中S1蛋白的表達量明顯多于未替換啟動子的轉染細胞。為檢測以上4種真核表達質粒的免疫原性，將重組質粒對7日齡SPF雛雞進行首免，21日齡二免，同時設立IBV滅活疫苗組及PBS空白對照組。采用間接ELISA試驗檢測首免后7、14、21、28天的血清中IB

6、V特異性抗體。首免后28天，用IBV ZY3病毒株對各組進行攻毒，統(tǒng)計發(fā)病和死亡情況，攻毒14天后，處死所有試驗雞并觀察和統(tǒng)計各組的剖解病變情況。結果顯示:以上4種質粒免疫雞的血清中均可檢測到IBV特異性抗體，啟動子替換質粒組的抗體效價在首免后的4個時間點均比啟動子未替換質粒組高，且差異顯著(P＜0.05); pCIneo-act-S1免疫組的抗體水平在4個質粒免疫組中始終最高，且除一免后2周外，其余時間點均比滅活疫苗組高;啟動子替換質