降鈣素基因相關肽抑制異丙腎上腺素誘導心肌重構的作用及機制研究.pdf

1、背景：
　　 心肌重構是指心肌在多種病理情況下(如缺血、壓力超負荷等)作出的適應性反應,包括心肌細胞肥大、間質纖維化和心肌細胞凋亡等。早期的重構在短期內對維持心功能具有一定的積極作用,但持續(xù)的重構會導致心功能失代償而出現(xiàn)心力衰竭。最近的研究表明,辣椒素敏感的感覺神經(jīng)功能低下以及microRNA-1、microRNA-133a和結締組織生長因子(CTGF)的表達異?？赡軈⑴c了心肌重構的形成。敲除辣椒素受體(VR1)可加重心肌缺血誘

2、導的心肌重構,激活VR1促進感覺神經(jīng)遞質的釋放則具有改善心功能的作用,說明病理狀態(tài)下的心肌重構可能與感覺神經(jīng)功能低下有關。吳茱萸次堿(Rut)是從中藥吳茱萸中提取的一種生物堿,可通過激活VR1促進感覺神經(jīng)遞質——降鈣素基因相關肽(CGRP)的合成和釋放發(fā)揮一系列的心血管保護作用。基于心肌重構可能與感覺神經(jīng)功能低下有關,因此本實驗以異丙腎上腺素(Iso)誘導的心肌重構為模型,探討降鈣素基因相關肽(CGRP)在心肌重構中的作用和機制;并探討

3、吳茱萸次堿(Rut)對心肌重構的作用和機制。
　　 方法：
　　 動物實驗：
　　 SD大鼠每天皮下給予Iso(5mg/kg,連續(xù)10天)誘導心肌重構模型,Rut治療組在皮下注射Iso的同時,灌胃給予不同劑量的Rut(10mg/kg或40mg/kg)。給藥結束后,檢測大鼠心臟結構的變化(超聲心動圖);分離心臟,測量全心重與體重以及左心室重與體重的比值;觀察心肌細胞大小的改變(蘇木素.伊紅染色)以及肥大標志物心鈉素

4、(ANP)和腦鈉素(BNP)mRNA表達(RT-PCR)的變化;檢測心肌細胞凋亡指數(shù)(TUNEL染色)以及凋亡相關基因Bax和Bcl-2mRNA的表達(RT-PCR);觀察心肌膠原沉積(Masson染色)以及Ⅰ、Ⅲ型膠原和結締組織生長因子(CTGF)mRNA表達(RT-PCR)的變化;檢測心肌組織microRNA-1和microRNA-133a的表達(real-time PCR);取血漿和背根神經(jīng)節(jié)分別檢測CGRP的血漿濃度(放射免疫法

5、)和α、β-CGRPmRNA的表達(RT-PCR)。
　　 細胞實驗：
　　 體外培養(yǎng)的心肌細胞和心肌成纖維細胞,以Iso來誘導心肌細胞的凋亡和成纖維細胞的增殖,CGRP在Iso處理前1h給予。藥物處理結束后,觀察細胞活力的變化(MTT)以及心肌細胞凋亡的改變(Hoechest染色和流式細胞術);檢測心肌細胞Bax和Bcl-2以及成纖維細胞Ⅰ、Ⅲ型膠原和結締組織生長因子(CTGF)mRNA的表達(RT-PCR);觀察心肌

6、細胞microRNA-1和microRNA-133a表達的變化(real-time PCR)以及細胞內活性氧(ROS)水平的改變(DCFH-DA熒光法)。
　　 結果：
　　 動物實驗：
　　 與對照組相比,給予Iso后可明顯增加大鼠的收縮末左室內徑(LEVDs)、收縮末左室后壁厚度(LVPWTs)和舒張末左室后壁厚度(INPWTd)以及全心重與體重、左心室重與體重的比值,同時心肌細胞橫截面積和ANP、BNP m

7、RNA的表達也顯著增加;心肌細胞凋亡指數(shù)和Bax mRNA的表達較對照組明顯升高,而Bcl-2的mRNA表達則顯著降低;給予Iso后大鼠心肌組織中膠原的沉積以及Ⅰ、Ⅲ型膠原和CTGF mRNA的表達顯著增加;Iso還可明顯上調microRNA-1的表達,而microRNA-133a的表達則顯著下調;Iso處理大鼠后可顯著降低背根神經(jīng)節(jié)α、β-CGRP mRNA的表達和血漿中CGRP的濃度。給予Rut可顯著促進CGRP的合成和釋放,同時心

8、肌重構得到明顯的改善,而預先應用CGRP耗竭劑——辣椒素耗竭CGRP后則可取消Rut的上述有益作用。
　　 細胞實驗：
　　 在心肌細胞,Iso處理后可顯著降低細胞的活性,增加心肌細胞的凋亡;促凋亡基因Bax mRNA的表達在Iso處理后明顯上調,而抗凋亡基因Bcl-2 mRNA的表達并無顯著性改變,導致Bax與Bcl-2的比值明顯增加;Iso可明顯上調心肌細胞microRNA-1的表達以及下調microRNA-133a

9、的表達;另外,Iso處理后還可顯著升高細胞內ROS的水平;預先給予CGRP后,可明顯降低ROS的產(chǎn)生以及抑制Iso誘導的microRNA-1和microRNA-133a表達的變化,同時心肌細胞的凋亡也顯著降低,但CGRP的這種保護作用可被CGRP受體拮抗劑CGRP8-37所取消。在心肌成纖維細胞,Iso處理后可明顯增加細胞的增殖活性;Ⅰ、Ⅲ型膠原和結締組織生長因子(CTGF)mRNA的表達也顯著增加;細胞內ROS的水平在Iso處理后也明

10、顯高于對照組;預先應用CGRP后也可顯著抑制Iso的上述效應,同樣,CGRP的這種保護作用可被CGRPs-37所取消。
　　 結論1.辣椒素敏感感覺神經(jīng)的功能減弱以及miRNA-1、miRNA-133a和CTGF的表達異常可能參與了Iso誘導的心肌重構的形成;2.Rut可抑制Iso誘導的心肌重構,其機制與激活VR1促進CGRP的合成和釋放,進而調節(jié)miRNA-1、miRNA-133a和CTGF的表達有關;3.CGRP對miRNA