降鈣素基因相關肽-MAPK信號途徑在銀屑病發(fā)病機制中作用的研究.pdf

1、降鈣素基因相關肽對表皮角質(zhì)形成細胞增殖和表達血管內(nèi)皮生長因子的影響背景銀屑病是一種常見的慢性炎癥性皮膚病，其病因和發(fā)病機制至今未完全闡明。角質(zhì)形成細胞(keratinocytes，KC)過度增生、炎癥細胞浸潤、新生血管形成是銀屑病組織病理學最主要的特征。近來的研究發(fā)現(xiàn)血管生成的異常不但是銀屑病特征性病理改變，而且可能是該病重要的啟動因素。在銀屑病的組織病理變化中真皮乳頭血管的異常最先發(fā)生，而后出現(xiàn)炎癥細胞的移行和表皮增生及分化異常，由此

2、啟動銀屑病發(fā)生發(fā)展過程。同時，在血管的增生、迂曲以及滲透性增加的基礎上，大量的免疫活性細胞如：T淋巴細胞、外周單核細胞、肥大細胞及其分泌的細胞因子滲出到血管外的組織中，誘導KC活化、增殖并分泌大量細胞因子，反過來促進血管異常的加重，由此形成細胞因子相互調(diào)控的惡性循環(huán)，促進疾病的進展。 因此本研究擬在體外培養(yǎng)的HaCaT細胞中，以主要由KC細胞分泌的血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth

3、factor，VEGF)為主要指標，觀察CGRF對KC增殖和表達VEGF的影響及其可能的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導機制，以闡明CGRP在銀屑病發(fā)病、發(fā)展中作用機制具有重要意義。 目的 1.觀察CGRP對人角質(zhì)形成細胞株--HaCaT細胞增殖效應的影響； 2.觀察CGRP對HaCaT細胞表達VEGF的影響： 3.探討CGRP受體、MAPK信號途徑在CGRP誘導的HaCaT細胞增殖以及表達VEGF中的作用。 方法

4、 1.HaCaT細胞的培養(yǎng)用含10﹪FBS的DMEM置37℃ CO<,2>培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。 2．實驗設計1)HaCaT細胞給予不同濃度CGRP(0.1 nM、1 nM、10 nM、100 nM)孵育，測定HaCaT細胞增殖及VEGFmRNA和蛋白表達； 2) HaCaT細胞給予CGRP孵育5～60min，部分給予CGRP受體拮抗劑CGRP8-37、MEK(ERK1/2上游分子)阻斷劑PD98059、p38 MAPK阻斷

5、劑SB203580或JNK阻斷劑SP6001259預處理，測定ERK1/2、p38、JNK磷酸化改變； 3) HaCaT細胞給予CGRP孵育，部分給予CGRP8-37、PD98059、SB203580或SP6001259預處理，測定HaCaT細胞增殖和VEGFmRNA及蛋白表達。 3．甲基噻唑基四唑(Methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)法測定HaCaT細胞增殖將HaCaT細胞分組給予不同干預

6、，加入MTT繼續(xù)培養(yǎng)4h，再加入二甲基亞砜，使結(jié)晶物充分溶解，在酶聯(lián)免疫檢測儀490nm處測量各孔吸光值。 4．實時熒光定量聚合酶鏈式反應(real-time PCR)檢測VEGFmRNA表達將所收集的細胞提取總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應得到cDNA，以管家基因β-actin作為參照，通過real-time RT-PCR技術(shù)檢測VEGF mRNA的表達。 5．雙抗體夾心ELISA法檢測VEGF蛋白表達將所收集的細胞培養(yǎng)上清進行

7、孵育、酶反應、顯色等步驟，酶聯(lián)免疫檢測儀450nm處測量各孔吸光值，根據(jù)標準曲線計算出相應濃度。 6．Western blot檢測ERK1/2、p38、JNK蛋白表達將所收集的細胞提取總蛋白，經(jīng)過SDS．聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離、轉(zhuǎn)膜、蛋白印跡、DAB顯色、凝膠成像系統(tǒng)成像、Totallab成像分析軟件進行半定量分析，檢測ERK1/2、p38、JNK蛋白的表達。 結(jié)論 1.CGRP在一定

8、范圍內(nèi)(0.1 nM、1 nM、10 nM)濃度依賴性促進HaCaT細胞增殖； 2.CGRP可以上調(diào)HaCaT細胞VEGF mRNA和蛋白表達； 3.CGRP可以時間依賴性活化HaCaT細胞ERK1/2、p38和JNK，CGRP受體可能參與了CGRP對ERK1/2、p38和JNK活化； 4.CGRP受體、ERK1/2和p38 MAPK信號途徑的活化可能在CGRP誘導的HaCaT細胞的增殖中發(fā)揮重要作用；CGRP受

9、體、ERK1/2信號途徑可能參與了CGRP上調(diào)HaCaT細胞VEGF表達的調(diào)控機制。 因此，本研究擬通過觀察尋常型銀屑病病人皮損部位、非皮損部位和正常人皮膚組織中ERK1/2、p38、JNK的表達情況，以期探討MAPK信號分子在銀屑病發(fā)病中的病理生理學意義，研究的結(jié)果也可為尋找抗銀屑病的靶位提供一些線索。 目的 檢測尋常型銀屑病病人皮損部位、非皮損部位和正常人皮膚組織中ERK1/2、p38、JNK的表達情況，初步

10、探討MAPK信號分子與銀屑病的關方法1.標本來源銀屑病病人12例均來自山東大學齊魯醫(yī)院皮膚科就診患者，所有病例均經(jīng)臨床確診為尋常型銀屑病穩(wěn)定期。所有患者近2周未外用糖皮質(zhì)激素，近1個月未接受糖皮質(zhì)激素及其它免疫抑制劑系統(tǒng)治療。取材部位：軀干部或四肢部位局麻下切取1.0×0.5cm大皮損組織塊，距皮損大于2cm的未受累的部位切取1.0×0.5cm大非皮損組織塊。正常對照皮膚10例，來自本院美容整形手術(shù)病例。 2.免疫印跡檢測分別取

11、銀屑病病人皮損區(qū)、非皮損區(qū)以及正常人皮膚組織，提取總蛋白，經(jīng)過SDS.聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離、轉(zhuǎn)膜、蛋白印跡、DAB及ECL顯色等步驟，檢測ERK1/2、p38、JNK和p-ERK1/2、p-p38、p-JNK的表達的表達，并經(jīng)凝膠成像分析系統(tǒng)半定量分析。 3.免疫組織化學檢測取銀屑病病人皮損區(qū)、非皮損區(qū)以及正常人皮膚組織進行p-ERK1/2、p-p38、p-JNK免疫組織化學檢測，所用一抗包括抗p-ERK1

12、/2單克隆抗體(1：100)，抗p-p38單克隆抗體(1：100)，抗p-JNKl/2多克隆抗體(1：100)。 結(jié)果 1.銀屑病病人皮損處、非皮損處及正常人皮膚ERK1/2和p-ERK1/2表達的檢測結(jié)果Western blot的結(jié)果表明銀屑病病人皮損部位p-ERK1/2水平較非皮損部位顯著增高(p<0.05)，ERK1/2蛋白的水平差異無統(tǒng)計學意義。 p-ERK1/2免疫組織化學染色分析：染色陽性信號為棕色顆

13、粒，銀屑病病人皮損部位p-ERK1/2主要表達于表皮各層細胞的胞漿及胞核中，以胞核陽性表達為主，胞核內(nèi)可見濃密的棕褐色顆粒；成纖維細胞和血管內(nèi)皮細胞胞核均有陽性表達；p-ERK1/2在銀屑病病人非皮損部位和正常人皮膚中主要表達于表皮各層細胞的胞漿中，少數(shù)基底層、棘層細胞胞核中可見淺棕色顆粒。 2.銀屑病病人皮損處、非皮損處及正常人皮膚p38和p-p38表達的檢測結(jié)果Western blot的結(jié)果表明銀屑病病人皮損部位p-p38水平較非皮

14、損部位顯著增高(p<0.05)，p38蛋白的水平差異無統(tǒng)計學意義。 p-p38免疫組織化學染色分析：染色陽性信號為棕色顆粒，銀屑病病人皮損部位p-p38主要表達于表皮各層細胞的胞漿及胞核中，胞漿、胞核內(nèi)可見濃密的深棕色顆粒；成纖維細胞和血管內(nèi)皮細胞胞核均可見深棕色顆粒；p-p38在銀屑病病人非皮損部位和正常人皮膚中主要表達于表皮各層細胞的胞漿中，少數(shù)基底層、棘層細胞胞核中可見淺棕色顆粒。 3.銀屑病病人皮損處、非皮損處及

15、正常人皮膚JNK和p-JNK表達的檢測結(jié)果Western blot的結(jié)果表明銀屑病病人皮損部位和非皮損部位皮膚p-JNK和JNK水平兩者之間差異無統(tǒng)計學意義。 p-JNK免疫組織化學染色分析：染色陽性信號為棕色顆粒，銀屑病病人皮損部位、非皮損部位和正常人皮膚中主要表達于表皮各層細胞的胞漿中，胞漿內(nèi)可見淺棕色顆粒，少數(shù)基底層、棘層細胞胞核中也有淺棕色顆粒。 結(jié)論 1.銀屑病皮損中p-ERK1/2和p-p38的表達明