降鈣素基因相關(guān)肽-MAPK信號(hào)途徑在銀屑病發(fā)病機(jī)制中作用的研究.pdf

1、降鈣素基因相關(guān)肽對(duì)表皮角質(zhì)形成細(xì)胞增殖和表達(dá)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的影響背景銀屑病是一種常見(jiàn)的慢性炎癥性皮膚病，其病因和發(fā)病機(jī)制至今未完全闡明。角質(zhì)形成細(xì)胞(keratinocytes，KC)過(guò)度增生、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、新生血管形成是銀屑病組織病理學(xué)最主要的特征。近來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)血管生成的異常不但是銀屑病特征性病理改變，而且可能是該病重要的啟動(dòng)因素。在銀屑病的組織病理變化中真皮乳頭血管的異常最先發(fā)生，而后出現(xiàn)炎癥細(xì)胞的移行和表皮增生及分化異常，由此

2、啟動(dòng)銀屑病發(fā)生發(fā)展過(guò)程。同時(shí)，在血管的增生、迂曲以及滲透性增加的基礎(chǔ)上，大量的免疫活性細(xì)胞如：T淋巴細(xì)胞、外周單核細(xì)胞、肥大細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子滲出到血管外的組織中，誘導(dǎo)KC活化、增殖并分泌大量細(xì)胞因子，反過(guò)來(lái)促進(jìn)血管異常的加重，由此形成細(xì)胞因子相互調(diào)控的惡性循環(huán)，促進(jìn)疾病的進(jìn)展。 因此本研究擬在體外培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞中，以主要由KC細(xì)胞分泌的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth

3、factor，VEGF)為主要指標(biāo)，觀察CGRF對(duì)KC增殖和表達(dá)VEGF的影響及其可能的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，以闡明CGRP在銀屑病發(fā)病、發(fā)展中作用機(jī)制具有重要意義。 目的 1.觀察CGRP對(duì)人角質(zhì)形成細(xì)胞株--HaCaT細(xì)胞增殖效應(yīng)的影響； 2.觀察CGRP對(duì)HaCaT細(xì)胞表達(dá)VEGF的影響： 3.探討CGRP受體、MAPK信號(hào)途徑在CGRP誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞增殖以及表達(dá)VEGF中的作用。 方法

4、 1.HaCaT細(xì)胞的培養(yǎng)用含10﹪FBS的DMEM置37℃ CO<,2>培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。 2．實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)1)HaCaT細(xì)胞給予不同濃度CGRP(0.1 nM、1 nM、10 nM、100 nM)孵育，測(cè)定HaCaT細(xì)胞增殖及VEGFmRNA和蛋白表達(dá)； 2) HaCaT細(xì)胞給予CGRP孵育5～60min，部分給予CGRP受體拮抗劑CGRP8-37、MEK(ERK1/2上游分子)阻斷劑PD98059、p38 MAPK阻斷

5、劑SB203580或JNK阻斷劑SP6001259預(yù)處理，測(cè)定ERK1/2、p38、JNK磷酸化改變； 3) HaCaT細(xì)胞給予CGRP孵育，部分給予CGRP8-37、PD98059、SB203580或SP6001259預(yù)處理，測(cè)定HaCaT細(xì)胞增殖和VEGFmRNA及蛋白表達(dá)。 3．甲基噻唑基四唑(Methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)法測(cè)定HaCaT細(xì)胞增殖將HaCaT細(xì)胞分組給予不同干預(yù)

6、，加入MTT繼續(xù)培養(yǎng)4h，再加入二甲基亞砜，使結(jié)晶物充分溶解，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490nm處測(cè)量各孔吸光值。 4．實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time PCR)檢測(cè)VEGFmRNA表達(dá)將所收集的細(xì)胞提取總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA，以管家基因β-actin作為參照，通過(guò)real-time RT-PCR技術(shù)檢測(cè)VEGF mRNA的表達(dá)。 5．雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)VEGF蛋白表達(dá)將所收集的細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行

7、孵育、酶反應(yīng)、顯色等步驟，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀450nm處測(cè)量各孔吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出相應(yīng)濃度。 6．Western blot檢測(cè)ERK1/2、p38、JNK蛋白表達(dá)將所收集的細(xì)胞提取總蛋白，經(jīng)過(guò)SDS．聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離、轉(zhuǎn)膜、蛋白印跡、DAB顯色、凝膠成像系統(tǒng)成像、Totallab成像分析軟件進(jìn)行半定量分析，檢測(cè)ERK1/2、p38、JNK蛋白的表達(dá)。 結(jié)論 1.CGRP在一定

8、范圍內(nèi)(0.1 nM、1 nM、10 nM)濃度依賴(lài)性促進(jìn)HaCaT細(xì)胞增殖； 2.CGRP可以上調(diào)HaCaT細(xì)胞VEGF mRNA和蛋白表達(dá)； 3.CGRP可以時(shí)間依賴(lài)性活化HaCaT細(xì)胞ERK1/2、p38和JNK，CGRP受體可能參與了CGRP對(duì)ERK1/2、p38和JNK活化； 4.CGRP受體、ERK1/2和p38 MAPK信號(hào)途徑的活化可能在CGRP誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞的增殖中發(fā)揮重要作用；CGRP受

9、體、ERK1/2信號(hào)途徑可能參與了CGRP上調(diào)HaCaT細(xì)胞VEGF表達(dá)的調(diào)控機(jī)制。 因此，本研究擬通過(guò)觀察尋常型銀屑病病人皮損部位、非皮損部位和正常人皮膚組織中ERK1/2、p38、JNK的表達(dá)情況，以期探討MAPK信號(hào)分子在銀屑病發(fā)病中的病理生理學(xué)意義，研究的結(jié)果也可為尋找抗銀屑病的靶位提供一些線(xiàn)索。 目的 檢測(cè)尋常型銀屑病病人皮損部位、非皮損部位和正常人皮膚組織中ERK1/2、p38、JNK的表達(dá)情況，初步

10、探討MAPK信號(hào)分子與銀屑病的關(guān)方法1.標(biāo)本來(lái)源銀屑病病人12例均來(lái)自山東大學(xué)齊魯醫(yī)院皮膚科就診患者，所有病例均經(jīng)臨床確診為尋常型銀屑病穩(wěn)定期。所有患者近2周未外用糖皮質(zhì)激素，近1個(gè)月未接受糖皮質(zhì)激素及其它免疫抑制劑系統(tǒng)治療。取材部位：軀干部或四肢部位局麻下切取1.0×0.5cm大皮損組織塊，距皮損大于2cm的未受累的部位切取1.0×0.5cm大非皮損組織塊。正常對(duì)照皮膚10例，來(lái)自本院美容整形手術(shù)病例。 2.免疫印跡檢測(cè)分別取

11、銀屑病病人皮損區(qū)、非皮損區(qū)以及正常人皮膚組織，提取總蛋白，經(jīng)過(guò)SDS.聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離、轉(zhuǎn)膜、蛋白印跡、DAB及ECL顯色等步驟，檢測(cè)ERK1/2、p38、JNK和p-ERK1/2、p-p38、p-JNK的表達(dá)的表達(dá)，并經(jīng)凝膠成像分析系統(tǒng)半定量分析。 3.免疫組織化學(xué)檢測(cè)取銀屑病病人皮損區(qū)、非皮損區(qū)以及正常人皮膚組織進(jìn)行p-ERK1/2、p-p38、p-JNK免疫組織化學(xué)檢測(cè)，所用一抗包括抗p-ERK1

12、/2單克隆抗體(1：100)，抗p-p38單克隆抗體(1：100)，抗p-JNKl/2多克隆抗體(1：100)。 結(jié)果 1.銀屑病病人皮損處、非皮損處及正常人皮膚ERK1/2和p-ERK1/2表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果Western blot的結(jié)果表明銀屑病病人皮損部位p-ERK1/2水平較非皮損部位顯著增高(p<0.05)，ERK1/2蛋白的水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 p-ERK1/2免疫組織化學(xué)染色分析：染色陽(yáng)性信號(hào)為棕色顆

13、粒，銀屑病病人皮損部位p-ERK1/2主要表達(dá)于表皮各層細(xì)胞的胞漿及胞核中，以胞核陽(yáng)性表達(dá)為主，胞核內(nèi)可見(jiàn)濃密的棕褐色顆粒；成纖維細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞胞核均有陽(yáng)性表達(dá)；p-ERK1/2在銀屑病病人非皮損部位和正常人皮膚中主要表達(dá)于表皮各層細(xì)胞的胞漿中，少數(shù)基底層、棘層細(xì)胞胞核中可見(jiàn)淺棕色顆粒。 2.銀屑病病人皮損處、非皮損處及正常人皮膚p38和p-p38表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果Western blot的結(jié)果表明銀屑病病人皮損部位p-p38水平較非皮

14、損部位顯著增高(p<0.05)，p38蛋白的水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 p-p38免疫組織化學(xué)染色分析：染色陽(yáng)性信號(hào)為棕色顆粒，銀屑病病人皮損部位p-p38主要表達(dá)于表皮各層細(xì)胞的胞漿及胞核中，胞漿、胞核內(nèi)可見(jiàn)濃密的深棕色顆粒；成纖維細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞胞核均可見(jiàn)深棕色顆粒；p-p38在銀屑病病人非皮損部位和正常人皮膚中主要表達(dá)于表皮各層細(xì)胞的胞漿中，少數(shù)基底層、棘層細(xì)胞胞核中可見(jiàn)淺棕色顆粒。 3.銀屑病病人皮損處、非皮損處及

15、正常人皮膚JNK和p-JNK表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果Western blot的結(jié)果表明銀屑病病人皮損部位和非皮損部位皮膚p-JNK和JNK水平兩者之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 p-JNK免疫組織化學(xué)染色分析：染色陽(yáng)性信號(hào)為棕色顆粒，銀屑病病人皮損部位、非皮損部位和正常人皮膚中主要表達(dá)于表皮各層細(xì)胞的胞漿中，胞漿內(nèi)可見(jiàn)淺棕色顆粒，少數(shù)基底層、棘層細(xì)胞胞核中也有淺棕色顆粒。 結(jié)論 1.銀屑病皮損中p-ERK1/2和p-p38的表達(dá)明