多次鹽酸灌注豚鼠食管氣道高反應(yīng)動(dòng)物模型呼吸道及內(nèi)臟傳入部位神經(jīng)源性炎癥的探討.pdf

1、目的:近年來，胃食管反流性疾病(gestroesophageal reflux disease，GERD)與支氣管哮喘的關(guān)系一直是共同關(guān)注的焦點(diǎn)，隨著有效的抑酸藥物和便攜式pH測試儀的出現(xiàn)，逐漸意識(shí)到胃食管反流(gestroesophageal reflux,GER)GER可能是哮喘的一個(gè)激發(fā)因素。為探討GERD與哮喘的關(guān)系，合適的動(dòng)物模型的建立是不可缺少的手段之一。目前認(rèn)為GER性呼吸系統(tǒng)疾病的主要原因是食管-支氣管反射和神經(jīng)源性炎癥

2、，即由于鹽酸刺激食管內(nèi)的酸敏感受體促發(fā)迷走神經(jīng)活動(dòng)產(chǎn)生的，GER通過該反射引起氣道高反應(yīng)。在酸性胃食管反流狀態(tài)下，由于食管-支氣管反射，氣道感覺神經(jīng)受到刺激，一方面，通過軸突反射釋放神經(jīng)肽，引起神經(jīng)源性炎癥；另一方面，沖動(dòng)傳至中樞，與孤束核及相應(yīng)節(jié)段脊髓背角的神經(jīng)元形成突觸，引起呼吸反射。研究發(fā)現(xiàn)該反射至少部分通過迷走神經(jīng)介導(dǎo)，反射弧的感受器分布在氣道上皮的感覺神經(jīng)末梢，它們的胞體位于結(jié)狀神經(jīng)節(jié)和上段脊神經(jīng)節(jié)(C7-T5)。P物質(zhì)(su

3、bstance P,SP)作為神經(jīng)肽家族中最重要的成員，其發(fā)揮多種生物學(xué)效應(yīng)是通過與其高親和力受體NK-1的結(jié)合來完成的。研究顯示，SP參與了哮喘和酸灌注食管的病理過程，但SP是否參與了胃食管反流性氣道高反應(yīng)的發(fā)病過程以及食管灌注鹽酸豚鼠模型的C7-T5脊神經(jīng)節(jié)和相應(yīng)節(jié)段脊髓背角內(nèi)的SP是否有變化目前尚不清楚。神經(jīng)生長因子(nerve growth factor,NGF)是哮喘發(fā)病過程中的一個(gè)重要介質(zhì)，支氣管哮喘動(dòng)物模型的研究結(jié)果顯示N

4、GF能引起氣道高反應(yīng)，但NGF是否參與GER性哮喘的發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚。故以多次鹽酸灌注豚鼠食管動(dòng)物模型為研究對(duì)象，探討SP在呼吸道和內(nèi)臟傳入部位的表達(dá)和NGF在肺組織中的表達(dá)。進(jìn)一步研究食管-支氣管反射及其相關(guān)的神經(jīng)源性炎癥的作用，試圖為食管一支氣管反射找出明確的解剖學(xué)證據(jù)。
　　 材料與方法:
　　 1、多次鹽酸灌注豚鼠食管氣道高反應(yīng)動(dòng)物模型的建立
　　 普通級(jí)健康雄性白化豚鼠30只，體重350g～450g

5、，隨機(jī)分為3組：A組：PBS對(duì)照組；B組：HCL模型組；C組：鹽酸灌注+SR140333干預(yù)組。食管酸灌注法：鹽酸氯胺酮注射液50g/L腹腔注射(1mL/kg)輕度麻醉豚鼠，仰臥固定于手術(shù)臺(tái)，經(jīng)口插5F胃管入食管的中、下段，以8滴/min速率緩慢灌注0.1mmol/L HCl(含0.5％胃蛋白酶)溶液，每次20min,每天一次，連續(xù)14d。對(duì)照組：用PBS代替鹽酸灌注食管，方法同上。拮抗劑用法：將SR140333溶于1％DMSO的蒸餾水

6、中，配成0.5mg/ml，按lmg/kg在每次灌酸前30分鐘進(jìn)行腹腔注射。
　　 2、氣道反應(yīng)性測定
　　 所有豚鼠于末次灌注后24h行氣道反應(yīng)性測定，戊巴比妥腹腔注射麻醉，將三組豚鼠應(yīng)用AniRes2005實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肺功能檢測分析系統(tǒng)(北京貝蘭博科技有限公司)檢測氣道阻力。
　　 3、取支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALA)，BALF細(xì)胞成分計(jì)數(shù)；血管灌注，豚鼠處死

7、，取豚鼠食管，氣管，肺組織， C7-T5段脊髓和相應(yīng)節(jié)段脊神經(jīng)節(jié)。
　　 4、HE染色觀察食管，氣管和肺組織病理變化
　　 將豚鼠食管、氣管和肺組織OCT包埋、切片后，進(jìn)行HE染色，光鏡下觀察并照相。
　　 5、免疫組織化學(xué)染色檢測SP和NGF的表達(dá)
　　 取對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組、干預(yù)組的氣管、肺組織、C7-T5段脊髓和相應(yīng)節(jié)段脊神經(jīng)節(jié)切片，參照二步法免疫組織化學(xué)試劑盒步驟測定各部位SP和NGF的表達(dá)情況。

8、r>　　 6、RT-PCR檢測肺組織、C7-T5段脊髓SP的表達(dá)，圖像分析。
　　 7、免疫印跡檢測肺組織中NGF的表達(dá)
　　 肺組織中蛋白提取和定量后，取等量樣品進(jìn)行聚丙烯凝膠電泳，經(jīng)一抗和二抗孵育后顯色，圖像分析。
　　 8、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 所有原始數(shù)據(jù)采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有結(jié)果均表示為-x±s，樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析方法，正態(tài)分布及方差齊時(shí)，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)

9、；非正態(tài)分布采用軼和檢驗(yàn)，p＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 1、三組豚鼠食管、氣管和肺組織病理檢測
　　 食管病理學(xué)HE染色顯示，可見正常對(duì)照組豚鼠食管結(jié)構(gòu)基本正常；模型組豚鼠食管上皮層不同程度增厚，以基底層及刺層細(xì)胞增生為主，上皮角化過度，乳頭延長；固有層中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤；粘膜下層內(nèi)血管擴(kuò)張，充血，符合輕度食管炎改變。支氣管肺組織病理學(xué)HE染色顯示，對(duì)照組豚

10、鼠支氣管肺組織結(jié)構(gòu)基本正常；模型組氣管可見纖毛柱狀上皮明顯增生，部分上皮脫落，粘膜和粘膜下層血管充血、擴(kuò)張，腺體增生、肥大，杯狀細(xì)胞增多，炎癥細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤，肺組織、細(xì)支氣管管壁及管腔內(nèi)可見大量淋巴細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞浸潤，細(xì)支氣管管壁增厚，管腔狹窄，部分可見粘液栓。SR140333干預(yù)組模型的病理變化均較實(shí)驗(yàn)組有所減輕。
　　 2、氣道反應(yīng)性測定
　　 隨著乙酰膽堿濃度的成倍遞增，

11、模型組與對(duì)照組的呼氣阻力均有增加，當(dāng)濃度到達(dá)25μg/kg體重以上時(shí)，模型組與對(duì)照組比較有顯著差異(P＜0.01)。給予SR140333干預(yù)后，呼氣阻力較實(shí)驗(yàn)組明顯改善。
　　 3、BALF中白細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類
　　 模型組BALF中細(xì)胞總數(shù)及嗜酸細(xì)胞百分比均高于對(duì)照組(P＜0.01)。給予SR140333干預(yù)后，與模型組比較明顯減少。
　　 4、免疫組織化學(xué)染色及分析
　　 正常對(duì)照組、模型組和SR140

12、333干預(yù)組支氣管、肺組織、C7-T5段脊神經(jīng)節(jié)和相應(yīng)節(jié)段脊髓背角中均有SP的表達(dá)，但強(qiáng)弱不同，模型組明顯高于其他兩組(P＜0.01)。模型組下呼吸道NGF的表達(dá)明顯高于正常對(duì)照組(P＜0.01)。
　　 5、RT-PCR檢測SP的表達(dá)
　　 各組肺組織和C7-T5段脊髓背角中SP含量不同，模型組高于正常對(duì)照組、SR140333抗體組(P＜0.01)。
　　 6、免疫印跡檢測NGF的表達(dá)
　　 模型組和對(duì)

13、照組NGF蛋白含量不同，模型組高于對(duì)照組。
　　 結(jié)論:
　　 1、成功建立了多次鹽酸灌注豚鼠食管氣道高反應(yīng)動(dòng)物模型，為進(jìn)一步探討GERD與哮喘的關(guān)系提供了幫助。
　　 2、SP在豚鼠下呼吸道、C7-T5段脊模型較對(duì)照組明顯增加。提示胃食管反流性氣道高反應(yīng)存在氣道神經(jīng)源性炎癥，并且神經(jīng)源性炎癥參與了胃食管反流性氣道高反應(yīng)的中樞神經(jīng)的發(fā)病機(jī)制。
　　 3、NK-1受體拮抗劑可以降低多次鹽酸灌注豚鼠食管氣道高